普通ECL化学发光检测试剂盒

Cat No : PK10001

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产品介绍

Proteintech 研发的普通ECL 化学发光检测试剂盒是免疫印迹实验中与辣根过氧化物酶(HRP)配套使用的底物检测试剂盒。本产品能够在HRP 的催化下发生化学反应而发光,可用于检测固定在膜上的蛋白质等生物大分子,其高灵敏度能够检测ng 级别的抗原,发光信号强烈持久,可以使用照相技术(X-光胶片曝光)或者其他成像方法(如荧光或化学发光成像仪)进行检测。  

组分

100 mL

200 mL

500 mL

A液

50 mL100 mL250 mL
B液50 mL100 mL250 mL


保存条件

4℃避光保存,一年有效。

使用方法

1. Western 二抗孵育后,印迹膜经过数次充分洗涤后,用平头镊将膜取出,用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白质),然后置于一洁净器皿内或是保鲜膜上。 

2. 根据印迹膜大小,将A 液与B 液等体积混合,配制为发光检测底物工作液(使用量约为每 10 cm2 膜 1 mL 或者根据个人实验习惯使用)。滴加发光底物工作液到印迹膜上,确保工作液均匀覆盖在膜上,放置1-2 分钟。

3. 取膜,弃发光底物工作液,用吸水纸略吸去过多的液体,将膜放置于两片洁净保鲜膜中间,此过程应小心完成,避免膜与膜之间产生气泡。随后进行压片检测或是荧光成像仪检测。

4. 压片检测:将膜固定于片夹内,暗室内压片1 分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间。或直接分别压片30秒、1、3、5 分钟,然后一起显影定影观察结果。

5. 荧光成像仪检测:将膜放置到荧光成像仪内,参照仪器说明书进行检测。 

注意

1. 为获得最佳实验结果,请务必优化实验条件,包括检测样品的用量、一抗和二抗稀释度、杂交膜及封闭试剂的选择。

2. 务必使用推荐的抗体稀释浓度以获得阳性结果,最佳抗原和抗体用量须通过预实验来确定。 

3. 由于奶粉中含有内源性生物素,在使用亲和素/生物素系统时,封闭液中应避免使用奶粉。

4. 由于叠氮钠是HRP 抑制剂,在缓冲液中应避免使用叠氮钠作为防腐剂。

5. 在与膜发生接触过程中,请佩戴手套且使用干净镊子等洁净器材,避免蛋白污染及高背景。

6. A 液和B 液在吸取过程中必须要更换枪头,A 液和B 液相互污染后会导致A 液或B 液逐渐失效,影响后续的使用效果。A 液与B 液混合后须尽快使用,放置过久会影响灵敏度。

7. 各溶液使用后,请盖紧瓶盖避光保存,以防失效。特别是B 液,含有氧化剂,比较容易被还原而失效。

8. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

问题解答:

问题可能原因解决方法

高背景(背景高或无特异性蛋白带)

一抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度

使用推荐的封闭液和 TBS/T 稀释抗体并 4℃孵育过夜 

化学发光检测时没有使用相应的膜

使用高质量的 NC 膜或 PVDF 膜

膜封闭不足导致一抗或二抗产生大量的非特异性结合

用含 5%脱脂奶粉的 TBS/T 在室温封闭 1-2 小时

二抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度,或二抗的特异性差

一些二抗会与蛋白产生非特异性的结合。因此在检测中可加入一步二抗的对照试验,在没有一抗的情况下,直接加入二抗孵育。也可将二抗用含 5%脱脂奶粉的 TBS/T 在室温下孵育 1 小时

配制试剂的用水水质不佳

在配制试剂时(尤其是磷酸化抗体)使用 Milli-Q 或其它超纯的去离子水

信号弱(检测不到信号)

一抗孵育不足

适当延长孵育时间(4℃孵育过夜)

转膜不完全

转膜时采用更高的电压和更长的时间。也可采用预染的蛋白 Marker 监控转膜的过程

封闭膜超时

缩短封闭膜的时间

蛋白的表达水平低于检测底限

在每孔中加入更多的蛋白;

采用免疫沉淀法富集蛋白;

换用表达高的样本或细胞;

检测前适当刺激蛋白的表达

二抗与一抗的结合率太低

提高二抗的浓度或换用与一抗匹配的二抗

配制试剂时发生交叉污染

重新配制各种试剂 



Publications

ApplicationTitle

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