Antibody Labeling Kits
Any antibody. Any color. Any time.
FlexAble系列是Proteintech研发的一种新型抗体标记试剂盒，采用独有的FlexLinker®抗体标记技术专利，能在任何抗体缓冲液条件下，10分钟将荧光染料、酶、以及其他分子与抗体结合，极大提高流式细胞术、免疫荧光及 免疫印迹实验效率。
-
与任何品牌一抗都兼容
-
单次可标记0.5ug抗体
-
适用于任何抗体浓度和配方
-
标记过程中抗体无损失
-
两步法10分钟快速标记
-
无需额外设备或更换缓冲液
FlexAble系列是Proteintech研发的一种新型抗体标记试剂盒，采用独有的FlexLinker®抗体标记技术专利，能在任何抗体缓冲液条件下，10分钟将荧光染料、酶、以及其他分子与抗体结合，极大提高流式细胞术、免疫荧光及 免疫印迹实验效率。
-
与任何品牌一抗都兼容
-
单次可标记0.5ug抗体
-
适用于任何抗体浓度和配方
-
标记过程中抗体无损失
-
两步法10分钟快速标记
-
无需额外设备或更换缓冲液
▲FlexAble操作流程图
操作流程：
-
进行标记之前，所有试剂需平衡至室温。
-
1 将0.5 μg抗体与1 μL FlexLiner混合后，
-
加入不高于8 μL的FlexBuffer。
-
注意：此处需要进行抗体质量换算：抗体质量=抗体浓度X体 积。若无法确定抗体浓度，
请参考《FlexAble常见问题》— “标记抗体量及浓度”文件。
-
2 室温避光孵育5 min
-
3 加2 μL FlexQuencher
-
4 室温避光孵育5 min
-
5 抗体标记完成，可直接使用，无需过滤纯化
-
可兼容任何品牌一抗
-
适用于任何抗体浓度和配方
-
适用于任何缓冲液
FlexAble是利用高亲和力的FlexLinker分子与抗体特异性结合，因此结合反应不受BSA或甘油等载体、Tris等含胺缓冲液或叠氮化钠等防腐剂的影响。
储存在不同指定浓度甘油中CD3抗体，无论标记过程中的甘油浓度如何，都能使用FlexAble 进行有效标记。图为用FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA023) 标记的
0.5 µg anti-human CD3 antibody (clone UCHT1, 65151-1-Ig) 对1X106人外周血单个核细胞(PBMCs)进行染色。
1、细胞固定及通透
-
1)
吸走培养基，用1×PBS缓冲液缓慢清洗种上细胞的细胞爬片。
-
2)
室温条件下，用4% PFA固定15 min或者使用-20℃甲醇或乙醇固定10 min。
-
3)
固定结束后，用1×PBS缓冲液清洗细胞爬片三次，3 min/次。
-
4)
室温条件下，用0.2% Triton X-100-PBS溶液将细胞通透处理5 min。细胞通透结束后，用1×PBS缓冲液清洗细胞爬片三次，3 min/次。
-
（注：如果使用的固定剂是有机溶剂，此步骤可免）
2、封闭
将样片置于干燥的培养皿内，滴加3% BSA-PBST（0.1% Tween）；将样片完全覆没放于湿盒中，室温封闭1 h或者4℃封闭过夜。
3、标记抗体制备
-
1)
将0.5 μg的一抗与1 μL FlexLinker混合后加入FlexBuffer补充体积至8 μL ，轻轻混匀，室温避光孵育5 min。
-
（注： 此处需要进行抗体质量换算：抗体质量=抗体浓度X体积。若无法确定抗体浓度，请参考《FlexAble常见问题》—“标记抗体量及浓度”文件。）
-
2)
加入2 μL FlexQuencher，混匀后，室温避光孵育5 min。
-
3)
使用PBS补充体积至50-100 μL。
4、抗体孵育
-
1)
用吸水纸将多余封闭液吸去，注意不要干片
-
2)
在样片上滴加一种FlexAble标记抗体（一抗+FlexLinker+FlexQuencher混合物）或多种FlexAble标记抗体混合物（将所有标记抗体混合在一起， 进行多重染色），室温避光孵育2 h或4℃避光孵育过夜。设置不加一抗的空白对照。
-
3)
用PBST（0.1% Tween）溶液清洗样片，洗涤3次，每次5 min。
-
4)
在样片上滴加DAPI，将完全浸没于DAPI的样片放于湿盒中室温避光孵育5-10 min。
-
5)
用PBS缓冲液清洗样片，快速冲洗3次。
-
6)
滴加封片剂，确定样品在盖玻片与载玻片之间，避免出现气泡。
-
7)
用荧光显微镜观察。根据不同的染料选择不同波段的激发光。
1.脱蜡 （注：石蜡切片染色前应置60℃ 1 h）
-
1)
在二甲苯Ⅰ号缸中浸泡20 min
-
2)
在二甲苯Ⅱ号缸中浸泡20 min
-
3)
在无水乙醇Ⅰ号缸中浸泡5 min；
-
4)
在无水乙醇Ⅱ号缸中浸泡5 min
-
5)
在95%乙醇中浸泡5 min
-
6)
在80%乙醇中浸泡5 min
-
7)
在60%乙醇中浸泡5 min
-
8)
用去离子水或者蒸馏水浸洗3遍，每遍1 min
-
注：此处Ⅰ号和Ⅱ号缸是指不同的容器，但是内容物一致
2、抗原修复
-
1)
将切片转移到容器中，并完全浸入到修复液内
-
2)
电炉或者水浴锅加热Tris-EDTA9（pH 9.0）、EDTA（pH 8.0）或者柠檬酸（pH 6.0）的修复缓冲溶液至95℃左右，放入组织切片加热10-15min
-
3)
载玻片浸没在缓冲液中自然冷却至室温
3、内源性过氧化氢酶灭活
取出切片，用去离子水浸洗3次，每次1 min，洗净后，将切片浸入装有3% 双氧水的溶液中，盖上盖子，室温密闭下，浸泡10 min。
（注： 如果实验体系不涉及HRP，此步骤可免）
4、标记抗体制备
-
1)
将0.5 μg一抗与1 μL FlexLinker混合后加入FlexBuffer补充体积至8 μL，轻轻混匀，室温避光孵育5 min。
-
（注： 此处需要进行抗体质量换算：抗体质量=抗体浓度X体积。若无法确定抗体浓度，请参考《FlexAble常见问题》—“标记抗体量及浓度”文件。）
-
2)
加入2 μL FlexQuencher，混匀后，室温避光孵育5 min
-
3)
使用TBS补充体积至50-100 μL
5、标记抗体孵育
-
1)
用1XTBS溶液冲洗载玻片3次，每次3 min。
-
2)
在1XTBS溶液中准备5 %封闭血清。在室温下将切片封闭1 h。（注：如果没有相应的血清，则用5 %的BSA替代）
-
3)
将切片上滴加一种FlexAble标记抗体（一抗+FlexLinker+FlexQuencher混合物）或多种FlexAble标记抗体混合物（将所有标记抗体混合物混 合在一起，进行多重染色），室温避光孵育2 h或4℃避光孵育过夜。设置不加一抗的空白对照
-
4)
用1XTBS溶液冲洗载玻片3次，每次3 min
6、封片及镜检
-
1)
DAPI室温孵育10 min，用1XTBS溶液快速冲洗3次
-
2)
将封片剂滴加在组织样本上，避光封片。在荧光显微镜下观察
-
1.
相同种属的抗体，需要分别标记后再混合进行实验。
-
3.
同时有直接法及间接法染色，推荐先做间接法染色，再使用直标抗体进行染色。
-
2.
不同种属的抗体，可以在一支EP管内同时标记。
-
4.
FlexAble标记抗体可以与直标抗体共染。 使用直标抗体进行染色。
应用示例：
染色顺序 （样本：小鼠结肠组织）：
-
黄色
-
洋红色
-
绿色
-
红色
-
蓝色
-
一抗：CD45重组兔单抗（货号：80297-1-RR）
二抗：CL555偶联重组羊抗兔二抗（货号：RGAR003）
-
一抗：CDH1兔多抗（货号：20874-1-AP）
FlexAble： CL647标记Rabbit IgG试剂盒（货号：KFA003）
-
一抗：FUS/TLS兔多抗（货号：11570-1-AP）
FlexAble：CL488标记Rabbit IgG试剂盒（货号：KFA001）
-
直标一抗：CL594偶联ACTA2 兔多抗（货号：CL594-14395）
-
DAPI
Q1：FlexLinker，FlexQuencher，FlexBuffer是否需要分装？
A：可以分装。FlexAble试剂盒经过50个冻融循环测试仍保持活性，分装可能会延长保质期
Q2：如何储存FlexAble抗体标记试剂盒？
A：-20℃保存1年，4℃保存6个月
Q3：一个试剂盒可以标记多少种不同的一抗？
A： FlexAble试剂盒50 rxns规格可以标记多达50种不同的抗体，使用FlexAble试剂盒 10 rxns规格可以标记多达10种抗体。
Q4：FlexAble试剂盒如何选？
A：需要要确认标记抗体的亚型，再进行选择。目前FlexAble可标记的抗体类型有：Rabbit IgG，Mouse IgG1，Mouse IgG2a，Mouse IgG2b，Human IgG，Rat Kappa Light Chain。 如：FlexAble Antibody Labeling Kit for Mouse IgG1只能标记Mouse IgG1一抗。
Q1：是否可以直接标记含有BSA、甘油、Tris缓冲液和/或防腐剂储存的一抗？
A：可以，FlexAble抗体标记试剂盒已经进行了验证。BSA、胺类缓冲液、50 %甘油、叠氮化钠等防腐剂都不会干扰标记效率。
Q2：标记的目标抗体是否需要稀释？
A：标记前的抗体不需要稀释，直接进行标记。
Q3：FlexAble能标记的抗体量是多少？
A：在一次标记反应中，可以标记至少0.5 μg的一抗。使用标准规格（50 rxns）的试剂盒，可以标记25 μg的一种抗体或多达50种不同的0.5 μg 抗体。
Q4：标记抗体量超过0.5 μg，如何按比例增加FlexLinker、FlexBuffer和FlexQuencher？
A：可以根据所需一抗的量按比例增加所需的试剂体积。参见下表的计算示例
| 抗体量 | 0.5 μg | 1 μg | 2.5 μg | 5 μg | 10 μg | 25 μg |
|---|---|---|---|---|---|---|
| FlexLinker 体积 | 1 μL | 2 μL | 5 μL | 10 μL | 20 μL | 50 μL |
| FlexBuffer 体积 | ≤ 8 μL | ≤ 16 μL | ≤ 40 μL | ≤ 80 μL | ≤ 160 μL | ≤ 400 μL |
| FlexQuencher 体积 | 2 μL | 4 μL | 10 μL | 20 μL | 40 μL | 100 μL |
| 总体积 | 10 μL | 20 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 500 μL |
Q5：FlexAble标记的一抗浓度是多少？抗体浓度很低或很高如何操作？
A：FlexAble标记方案是在总体积10 μL体系中使用0.5 μg一抗，抗体最终为0.05mg/mL。如果抗体浓度较低，可以适当增加FlexLinker及FlexQuencher 用量，使用总体积大于10 μL的体系。 FlexAble对高浓度的一抗没有限制。若抗体浓度很高，待移液体积过小，可将抗体用PBS缓冲液稀释至0.5-1 mg/mL再进行标记
Q6：一抗浓度未知，如何进行标记？
A：以下是常用抗体来源和浓度信息，可以用来估计一抗浓度：
-
血清来源的多克隆抗体：特异性抗体约1 mg/mL，总抗体约10 mg/mL
-
组织培养上清（含10%胎牛血清）来源的单克隆抗体：特异性抗体约0.05 mg/mL，总抗体约1 mg/mL
-
组织培养上清（无血清培养基）来源的单克隆抗体：特异性抗体约0.05 mg/mL，总抗体约0.05 mg/mL
-
腹水来源的单克隆抗体：特异性抗体约0.9- 9 mg /mL，总抗体约1- 10 mg /mL
（摘自《抗体：实验室手册》，E. Harlow & D. Lane, CSHL出版社，1988年出版）
Q7：不同物种的抗体如何标记？
A：1）.针对相同种属的抗体，需要分别标记后再混合一起进行实验。比如都是Rabbit IgG，或者都是Mouse IgG1抗体，或者Mouse的不同亚型抗体等，都需要分开标记。
2）.针对不同种属的抗体，可以混合标记。比如同时标记Rabbit IgG和Mouse IgG1抗体，此时可以混合在一支PE管中进行标记，直接添加相应的 FlexLinker和FlexQuencher。
Q1：是否需要去除未结合的FlexLinker？
A：未结合的FlexLinker可以通过添加FlexQuencher来中和。不需要额外的去除步骤（如超滤）。
Q2： FlexAble标记效率如何？标记后是否需要纯化？
A： FlexAble标记是无损耗标记，抗体回收率是100%。试剂盒中FlexLinker和FlexQuencher都是过量的，可以确保抗体100%标记后， FlexQuencher封闭剩余的染料，不让剩余染料影响实验体系和结果。标记完成后不需要纯化，可以将整个混合物进行实验。
Q3： 标记后的抗体实验之前是否需要稀释？
A：标记后的抗体需要根据样本类型，靶蛋白丰度以及抗体效价来确定是否稀释。可参考裸抗推荐稀释度。
Q4：FlexAble标记的一抗能否和间接法同时使用？
A：可以。先做间接法染色，再做直标抗体染色。
Q5：FlexAble标记的抗体可以保存多长时间？
A：4℃避光保存2周。FlexAble是微量标记，10分钟即可完成抗体标记，推荐即标即用，效果更好。
Q6：使用来自同一物种的两种FlexAble标记抗体时，是否会看到交叉反应或染料渗漏?
A：FlexAble用高亲和力的FlexLinker标记一抗。FlexLinker从一种抗体解离并结合到另一种抗体是非常罕见的。如果观察到渗漏，可添加更多的 FlexQuencher来去除未结合的FlexLinker，或者尝试使用标记的抗体进行依次染色。
Q7：如何减少实验背景？
A：实验背景主要是由一抗带来的，可以根据实验结果调整一抗和标记试剂盒的使用量来优化实验。
CoraLite Plus光谱
CoraLite®和CoraLite Plus染料是来自Proteintech的明亮荧光染料，具有很高的光稳定性和极小的荧光渗透。我们的FlexAble试剂盒与多种CoraLite®和CoraLite Plus染料结合，在多重标记实验中提供更大的灵活性。
CoraLite®和CoraLite Plus染料的亮度与Alexa Fluor®染料相当。由于荧光光谱重叠极小，每个荧光团可以同时用于共定位研究。FlexAble的CoraLite系列使免疫荧光、蛋白质印迹和流式细胞术的多重检测更快速、更简单。
Flexable 抗体标记试剂盒列表
Tips：在多重染色中，FlexAble 1.0适合高丰度蛋白抗体标记，FlexAble 2.0更适合中低丰度蛋白抗体标记；标记流式抗体，二者均可。
| 产品版本 | 偶联物 | 标记Rabbit IgG货号 | 标记 Mouse IgG1货号 | 标记Mouse IgG2a货号 | 标记Mouse IgG2b货号 | 标记Human IgG货号 | 标记Rat Kappa Light Chain货号 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| FlexAble | CoraLite® Plus 405 | KFA006 | KFA026 | KFA046 | KFA066 | KFA108 | - |
| FITC Plus | KFA008 | KFA028 | KFA048 | KFA068 | KFA109 | KFA126 | |
| CoraLite® Plus 594 | KFA009 | KFA029 | KFA049 | KFA069 | KFA112 | - | |
| HRP | KFA005 | KFA025 | KFA045 | KFA065 | KFA110 | - | |
| Biotin | KFA007 | KFA027 | KFA047 | KFA067 | KFA111 | KFA128 | |
| FlexAble1.0 （适合高丰度蛋白抗体标记） | CoraLite® Plus 488 | KFA001 | KFA021 | KFA041 | KFA061 | KFA104 | KFA121 |
| CoraLite® Plus 555 | KFA002 | KFA022 | KFA042 | KFA062 | KFA105 | KFA122 | |
| CoraLite® Plus 647 | KFA003 | KFA023 | KFA043 | KFA063 | KFA106 | - | |
| CoraLite® Plus 750 | KFA004 | KFA024 | KFA044 | KFA064 | KFA107 | - | |
| FlexAble2.0（更适合中低丰度蛋白抗体标记） | CoraLite® Plus 488 NEW | KFA501 | KFA521 | KFA541 | KFA561 | - | - |
| CoraLite® Plus 555 NEW | KFA502 | KFA522 | KFA542 | KFA562 | - | - | |
| CoraLite® Plus 647 NEW | KFA503 | KFA523 | KFA543 | KFA563 | - | - | |
| CoraLite® Plus 750 NEW | KFA504 | KFA524 | KFA544 | KFA564 | - | - |
Immunofluorescence of human kidney: FFPE human kidney sections were stained with anti-Calbindin antibody (14479-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, yellow), anti-ACE2 antibody (66699-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA023, magenta), CoraLite®488-conjugated Podocalyxin antibody (CL488-18150, green), and DAPI (blue).
Immunofluorescence of rat brain tissue: FFPE rat brain tissue sections were stained with anti-MAP2 antibody (17490-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, orange), anti-GFAP antibody (16825-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA003, magenta), and CoraLite®488-conjugated TDP-43 antibody (CL488-10782, green).
Immunofluorescence of rat brain tissue: FFPE rat brain tissue sections were stained with anti-NeuN antibody (66836-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA023, magenta), anti-TUBB3 antibody (66375-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA022, orange), and CoraLite®488-conjugated GFAP antibody (CL488-60190, green).
Immunofluorescence of HeLa: PFA-fixed HeLa cells were stained with anti-TDP43 antibody (10782-2-AP) labeled with FlexAble CoraLite® 488 Kit (KFA001, green), anti-Tom20 antibody (11802-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, red), and anti-Lamin B1 antibody (12987-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA003, cyan). Confocal images were acquired with a 100x oil objective and post-processed. Images were recorded at the Core Facility Bioimaging at the Biomedical Center, LMU Munich.
Immunofluorescence of HeLa: PFA-fixed HeLa cells were stained with anti-Lamin B1 antibody (66095-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® 488 Kit (KFA021, green), anti-HSP60 (66041-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA022, red), and anti-GORASP2 antibody (66627-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA023, cyan). Confocal images were acquired with a 100x oil objective and post-processed. Images were recorded at the Core Facility Bioimaging at the Biomedical Center, LMU Munich.
Immunofluorescence of HeLa: PFA-fixed HeLa cells were stained with anti-HSP60 antibody (66041-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA022, yellow), anti-GORASP2 antibody (66627-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA023, cyan), and DAPI (blue). Confocal images were acquired with a 100x oil objective and post-processed. Images were recorded at the Core Facility Bioimaging at the Biomedical Center, LMU Munich.
Immunofluorescence of HeLa: PFA-fixed HeLa cells were stained with anti-COXIV antibody (11242-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, yellow), anti-GM130 antibody (11308-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA003, magenta), and DAPI (blue). Confocal images were acquired with a 100x oil objective and post-processed. Images were recorded at the Core Facility Bioimaging at the Biomedical Center, LMU Munich.
Immunofluorescence of HeLa: PFA-fixed HeLa cells were stained with anti-TOM20 antibody (11802-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, yellow) and anti-Lamin B1 antibody (12987-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA003, cyan). Confocal images were acquired with a 100x oil objective and post-processed. Images were recorded at the Core Facility Bioimaging at the Biomedical Center, LMU Munich.
Flow cytometry of PBMC. 1X10^6 human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stained with 0.5 µg anti-human CD45 antibody (clone HI30, 65109-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 405 Kit (KFA026).
Flow cytometry of PBMC. 1X10^6 human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stained with 0.5 µg anti-HSP90 antibody (13171-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® 488 Kit (KFA001, cyan) or with isotype control antibody labeled with FlexAble CoraLite® 488 Kit (KFA001, red).
Flow cytometry of PBMC. 1X10^6 human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stained with 0.5 µg anti-human CD3 antibody (clone UCHT1, 65151-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® 488 Kit (KFA021).
Flow cytometry of Jurkat cells. 1X10^6 Jurkat cells were stained with 0.5 µg anti-HSP90 antibody (13171-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, cyan) or with isotype control antibody labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, red).
WB of HeLa cell lysates: HeLa cell lysates were detected with anti-GAPDH antibody (10494-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, green) and anti-NUDT21 antibody (66335-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA023, red).
WB of HEK293 cell lysates: siRNA transfected HEK293 cell lysates were detected with anti-GNA13 antibody (67188-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA022,green) and anti-PCNA antibody (60097-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA023, red).
WB of A431 cell lysates: siRNA transfected A431 cell lysates were detected with anti-P53 antibody (80077-1-RR) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, green) and anti-GAPDH antibody (10494-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA003, red).
WB of HeLa cell lysates: HeLa cell lysates were detected with anti-GAPDH antibody (10494-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA003, red) and anti-NUDT21 antibody (66335-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA022, green).
WB of HEK293 cell lysates: HEK293 cell lysates were detected with anti-GAPDH antibody (10494-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® 488 Kit (KFA001, green) and anti-NUDT21 antibody (66335-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 750 Kit (KFA024, red).
WB of HEK293 cell lysates: HEK293 cell lysates were detected with anti-GAPDH antibody (10494-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 750 Kit (KFA004, red) and anti-NUDT21 antibody (66335-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® 488 Kit (KFA021, green).
WB of A431 cell lysates: siRNA transfected A431 cell lysates were detected with anti-P53 antibody (80077-1-RR) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA002, green) and anti-PCNA antibody (60097-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA023, red).
WB of HepG2 cell lysates: siRNA transfected HepG2 cell lysates were detected with anti-CCDC111 antibody (29824-1-AP) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 647 Kit (KFA003, red) and anti-PCNA antibody (60097-1-Ig) labeled with FlexAble CoraLite® Plus 555 Kit (KFA022, green).