免疫印迹 (Immunoblotting) 又称蛋白质印迹 (Western blot, WB),是一种综合性的免疫学检测技术。它利用 SDS-PAGE 技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开,然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上,以固相膜上的蛋白质作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶标记的第二抗体起反应,经过底物显色或荧光成像等方法以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。


 一、电泳:
  1. 根据目标蛋白的分子量(MW)配置SDS-PAGE胶。(按照本文提出的建议和凝胶配方配制)

    Tip a :Tris-tricine gel比 Tris-glycine gel更好的分离低分子量蛋白 (<10kDa)。

    Tip b :梯度胶可以提供更清晰的条带,在一种凝胶上提供更大的蛋白检测范围,如10-500kDa。 
  2. 在EP管中制备样品。添加4x SDS样品缓冲液( Cat No : PR20003),使每个样品的总蛋白质量为30-50μg(根据Bradford或BCA蛋白质分析测定的蛋白质量)。

  3. 使用涡旋仪混合样品,然后加热至95-100℃,5分钟。

  4. 将凹槽中残留的胶清理干净,放置在电泳槽中,加入稀释好的SDS-PAGE 电泳液 (1x)(Cat No. PR20004)。

二、蛋白转移(以湿转为例): 
  1. 推荐使用PVDF膜(只有当目标蛋白分子量<20kDa时,使用0.22μm孔径的PSQ膜)。将膜在甲醇中浸泡30秒,用超纯水冲洗两遍,然后用Western Blot 湿法转膜液(Cat No. PR20010)浸泡。将滤纸和海绵也浸泡在转膜液中。

  2. 将胶从电泳槽中取出,浸泡在转膜液中。

  3. 以海绵/滤纸/膜/胶/滤纸/海绵的方式,将其紧密排列,确保各个夹层之间没有气泡。

  4. 采用恒流法(一般是200mA,90min)进行电转。

  5. 转移完成后,将膜取出,用超纯水冲洗两遍,放入Western Blot 封闭液(Cat No. PR20011)中进行封闭,室温两小时或4℃过夜。

    Tip c:如果目标MW大于150kDa,建议4°C湿转过夜,而且最好在转移缓冲液中添加0.005%SDS以便更好的转移大分子蛋白。

Tip d:如果需要观察蛋白转移情况,可用丽春红染膜,观察完用TBST(Cat No. PR20017)清洗干净

三、免疫印迹:
  1. 将膜从封闭液中取出,用1x TBST洗膜三次,每次5分钟。

  2. 根据推荐稀释度用抗体稀释液(Cat No. PR20013)稀释抗体,37℃孵育1小时或4°C过夜。

  3. 用1xTBST清洗膜三次,每次10分钟。

  4. 根据推荐稀释度稀释二抗,将膜放入其中孵育,37℃孵化1小时 。

  5. 用1xTBST清洗膜三次,每次10分钟。

  6. 用超纯水将膜冲洗两遍。

    Tip e:在实验过程中的任何阶段都要保持膜的润湿状态。
四、曝光:
  1. 将ECL化学发光检测试剂盒(Cat No. PK10002)中的ECL底物A液和B液1:1混匀后使用。

  2. 将ECL底物和膜充分反应后,用保鲜膜将膜包裹固定在暗夹上。

  3. 将膜暴露于暗照相膜或使用化学发光成像仪读取。

    Tip f:根据多次曝光时间来确定最佳曝光时间。
  4. 在曝光后的胶片上备注信息,如:曝光时间,泳道和样品名称。


五、相关试剂配方

4x SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(Cat No. PR20003

 

1 M Tris•HCl (pH 7.0)  母液

150 ml

甘油

250 ml

SDS

120 g

溴酚蓝

0.4 g

用超纯水补足体积到800ml, 分装 -20°C保存。
使用前按照4:1的体积比现加2M DTT溶液(或β-巯基乙醇)。

 

1x TBST(洗涤液)(Cat No. PR20017

 

Tris

2.42 g

NaCl

8.76 g

KCl

0.373 g

Tween-20

2 ml

用浓盐酸将PH调到7.4;用超纯水将体积补足到1000ml

 

湿法转膜液(Cat No. PR20010

 

Tris

2.9 g

甘氨酸

14.5 g

乙醇

200 ml

用超纯水将体积补足到1000ml

 

半干转缓冲液(用于Tris-Tricine胶转移)(Cat No. PR20008

 

Tris

36.3 g

醋酸

6 ml

甲醇

200 ml

用超纯水将体积补足到1000ml

 


六、SDS-PAGE 胶配方
1. 常规胶配方 

对于常规的大于10kDa蛋白,使用以下SDS-PAGE胶配方制备,根据分子量大小选择合适的胶浓度。配方如下:

分离胶(10 ml)

目的蛋白分子量 (kDa)

80-200

25-100

20-40

10-25

胶浓度

8%

10%

12%

15%

ddH₂O

3

 2.5

 2

 1.25

40%  丙烯酰胺母液

 2

 2.5

 3

 3.75

2x 分离胶缓冲液母液

 5.0

 5.0

 5.0

 5.0

10% 过硫酸铵母液

 0.1

 0.1

 0.1

0.1 

TEMED

 0.01

 0.01

 0.01

 0.01

 

浓缩胶

4 ml

6ml

8ml

目的蛋白分子量 (kDa)

-

-

-

胶浓度

4%

4%

4%

ddH₂O

1.6

2.4

3.2

40%  丙烯酰胺母液

0.4

0.6

0.8

2x 浓缩胶缓冲液母液

2.0

3.0

4.0

10% 过硫酸铵母液

0.04

0.06

0.08

TEMED

0.004

0.006

0.008

 

2x 分离胶缓冲液 (1000ml)

 

Tris

90.8 g

SDS

2.0 g

充分溶解后,用浓盐酸将PH调到8.8,然后用超纯水将体积补足到1000 ml。

 

2x 浓缩胶缓冲液 (1000 ml)

 

Tris

30.3 g

SDS

2.0 g

充分溶解后,用浓盐酸将PH调到6.8,然后用超纯水将体积补足到1000 ml。

 

1x SDS-PAGE电泳缓冲液 ( 1000 ml)(Cat No. PR20004

 

Tris

3.03 g

甘氨酸

18.75 g

SDS

1 g

充分溶解后,用超纯水将体积补足到1000ml。

2. Tris-Tricine 胶配方

对于分子量小于10KDa的,建议使用Tris-Tricine胶体系。配方如下:

Reagents

浓缩胶

间隙胶

分离胶

胶浓度

4%

10%

15%

体积

2 ml

1.5 ml

6 ml

37% 甘油母液

-

-

1.6ml

ddH₂O

1.51 ml

0.595 ml

-

40% 丙烯酰胺母液

0.2 ml

0.375 ml

2.25 ml

3M Tris HCl (pH 8.5)母液

-

0.5 ml

2.0 ml

1M Tris HCl (pH 6.8)母液

0.25 ml

-

-

10% SDS母液

0.02 ml

0.15 ml

0.06 ml

10% APS母液

0.02 ml

0.015 ml

0.06 ml

TEMED

0.002 ml

0.0015 ml

0.003 ml

 

1x Tris-Tricine阴极电泳缓冲液 ( 1000ml)

 

Tris

12.1 g

Tricine

17.9 g

SDS

1 g

充分溶解后,用超纯水将体积补足到1000 ml。

 

1x Tris-Tricine阳极电泳缓冲液 ( 1000ml)

 

Tris

24.23g

充分溶解后,用浓盐酸将PH调到8.9,然后用超纯水将体积补足到1000ml。

免疫化学( Immunochemistry),包含免疫组织化学( Immunohistochemistry, IHC)和免疫细胞化学( Immunocytochemistry, ICC),是利用抗原与抗体之间的结合具有高度特异性的原理,通过抗原抗体结合及呈色反应,显示组织或细胞中的化学成分,对组织切片或细胞标本中某些化学成分进行定性、定位或者定量研究。 

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一、脱蜡:

  • 在二甲苯(Ⅰ)中20min,在二甲苯(Ⅱ)中20min; 在无水乙醇(Ⅰ)和(Ⅱ)中各浸泡5min; 95%乙醇中浸泡5min; 80%乙醇中浸泡5min; 60%乙醇中浸泡5min; 单蒸水或去离子水中浸洗3次,每次1min。

二、抗原修复:

  • 取一定量的柠檬酸修复液(Cat No. PR30001)或 Tris-EDTA修复液(Cat No. PR30002于一耐高温容器里,将切片放入其中,再将容器放进微波炉中,power5或中火加热10min

  • 或者是在烧杯中加入一定量修复液于电炉上加热至沸腾,将切片置于切片架上放入加热的修复液中继续煮沸15min。完毕,放在室温自然冷却,30-40min后,降至室温。

三、免疫组织化学染色:

  1. 取出切片,单蒸水或去离子水中浸洗3次,每次1min

  2. 洗净后将切片浸入装有3%双氧水溶液的容器中,盖上盖子,室温密闭下,浸泡10min

  3. 取出切片,单蒸水或去离子水中浸洗3次,每次1min

  4. 甩干,擦净,滴加适量3%BSA,室温湿盒封闭1hour;

  5. 用吸水纸吸去多余液体(注意不要干片),滴加适量稀释好的一抗一抗用抗体稀释液稀释,室温湿盒孵育1hour4℃过夜;

  6. 1xTBST(Cat No. PR20017冲洗4-5次,每次30sec

  7. 甩干,擦净,滴加适量二抗,室温湿盒孵育30min;

  8. 1xTBS冲洗4-5每次30sec

  9. 甩干,擦净,滴加适量DAB溶液(Cat No. PR30010),2-5min后迅速用单蒸水或去离子水冲洗干净;(DAB工作液现配现用)

  10. 甩干,擦净, 滴加1Mayor's苏木精,复染1.5-2min,在TBS溶液中浸泡5-10min

  11. 取出切片,单蒸水或去离子水中浸洗3次,每次1min 

  12. 梯度酒精及二甲苯脱水:分别在60%,80%,95%酒精中浸泡5分钟,再在无水乙醇(Ⅰ)和(Ⅱ)中各浸泡5min,然后在二甲苯(III)和(IV)中各浸泡5分钟;

  13. 从二甲苯(IV)中取出切片,中性树胶封片,镜检。


 

免疫沉淀(Immunoprecipitation ,IP )是利用抗体抗原特性性结合的一种亲和纯化技术,广泛应用于从组织或细胞裂解物中富集、分离天然靶蛋白。


注意:操作样品尽量冰上或4℃进行。

一、样品准备
二、免疫沉淀
  1. 吸取含有1-3mg总蛋白的裂解物(或预处理)200-400μl,加入EP管中,同时加入1-4μg特异性抗体以及 150-300μl 孵育液,最佳抗体数量应由抗体效价决定。等量蛋白裂解物,加入等量孵育液等量同型IgG孵育作为Control IgG对照组。4℃ ,旋转2–4h过夜。

  2. 然后加入50μl重悬的 Protein A 琼脂糖珠 ,4℃ 旋转孵育1-4h。

  3. 4 500g 离心30s弃上清

  4. 每次用1mL 1× TBST(Cat No. PR20017现加蛋白酶抑制剂(Cat No. PR20016)洗涤沉淀复合物,4℃、500g 离心30s,吸弃上清;重复洗涤4-5次。最后一次洗涤/离心结束后,EP管中保留约80 ul 溶液(其余都吸弃)。

  5. 加20μl  5x SDS Sample Buffer,重悬IP复合物beads,95–100℃ 沸水浴 5min , 然后8,000-10,000g 离心3min, 小心吸取上清转入新的EP管中

三、WB 分析
  1. 将收集的IP样品加入SDS-PAGE对应泳道, 同样可以将剩余IP样品于-80保存备用。 

  2. 通过SDS-PAGE分离IP样品,并将蛋白质向PVDF膜转移。使用合适抗体进行后续检测。

Tip 6:  对IP样品进行WB检测时为了消除或减少样品中的抗体重轻链干扰可用HRP-抗兔轻链特异性二抗或HRP-Protein A来代替传统WB二抗. (相比变性抗体,HRP-Protein A对天然完整抗体有更好亲和力)

四、如何选择监测二抗
IP捕获抗体类型 WB检测时一抗类型 WB检测时二抗类型 备注说明
小鼠单抗/多抗 小鼠单抗 HRP-标记Protein A
或HRP一标记抗小鼠IgG二抗
WB 检测时一般的HRP-标记抗小鼠 IgG 二抗可产生严重的重链轻链干扰信号;HRP-标记 Protein A 可以有效降低重链信号强度,消减轻链信号;WB一抗若为 mouse IgG1/IgG3 亚型,HRP-标记 Protein A亲和力较低,可适当降低其稀释度(也可先尝试HRP-标记抗小鼠IgG二抗);WB一抗若为小鼠 IgM/IgA 亚型,则避免选择 HRP-标记 ProteinA,因其不结合。
小鼠多抗
兔抗 HRP-标记抗兔IgG二抗 由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体,故WB检测时使用 HRP-标记抗兔 IgG二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。
兔抗 小鼠单抗 HRP-标记抗小鼠IgG二抗 由于IP捕获抗体与WB检测一抗属于不同种属来源抗体,故WB检测时
使用HRP-标记抗小鼠IgG二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。
小鼠多抗
兔抗 1、HRP-标记Protein A
2、HRP-标记抗兔IgG轻链特异性抗体
1、WB检测时HRP-标记抗兔IgG二抗会产生很强的重链轻链信号,以及背景信号,对结果分析有一定影响;
2、HRP-标记Protein A可以有效降低重链信号以及消减轻链信号的影响,背景干净,适用于检测目的蛋白大小除45-55 kDa之外的所有目的蛋白,而目的蛋白大小在45-55 kDa之间时,推荐使用HRP-标记抗兔IgG轻链特异性二抗。
五、相关溶液

RIPA裂解液(Cat No. PR20001

配:1000 ml

Tris

6 g

NaCl

8.76 g

脱氧胆酸钠

5 g

SDS

1 g

NaF

0.42 g

EDTA.2Na.2H2O

1.86 g

Triton X-100

10 ml

盐酸调pH至7.4,补ddH₂O定容至1000 ml,4℃保存

注:PMSF及其它蛋白酶抑制剂现用现加 

 

5x SDS sample buffer

 For 50 ml

Tris HCl (1M母液,pH 7.0)

12.5 ml

甘油

17.5 ml

SDS

7.5 g

溴酚蓝

15 mg

补ddH₂O至37.5 ml, 分装并保存在-20℃

现用现加还原剂:25% ß-巯基乙醇或25% DTT(2M母液)

 

孵育液

配: 1000 ml

KCl

0.2 g

KH2PO4

0.2 g

Na2HPO4·12H2O

1.14 g

NaCl

8 g

NaF

0.42 g

EDTA.2Na.2H2O

1.86 g

盐酸调pH至7.4,补ddH₂O定容至1000 ml,4℃保存

染色质免疫沉淀(ChIP)是一种研究蛋白质与染色质DNA相互作用的技术,根据不同目的既可用于鉴定互作蛋白,也可用于鉴定互作DNA。通常被用于表观遗传学研究,如通过ChIP检测转录调节相关的组蛋白修饰。


 

操作步骤:

一、 样品准备(操作样品在冰上或4℃进行。

  • 对于悬浮细胞, 确保10 ml新鲜培养基中有合适数量的细胞,直接加37%甲醛至终浓度为1%摇晃混匀后,室温下摇床孵育10 min。
  • 对于组织, 液氮充分研磨组织至粉末状然后转移至15 ml或50 ml尖底管中,加入10 ml PBS(Cat No. PR20023 270 μl 37%甲醛至终浓度为1%摇晃混匀后,室温下摇床孵育10 min。
  1. 加入500 ul 2.5 M甘氨酸至终浓度0.125 M终止反应室温孵育5 min。

  2. 细胞转至50 ml尖底管中,42500 rpm离心5 min

  3. 弃上清,冰预冷PBS(pH 7.4)洗涤细胞2次,每次洗涤后42500 rpm离心5 min

  4. 用1 ml冰预冷细胞裂解液(Cat No. PR20001,现加蛋白酶抑制剂(Cat No. PR20016)),重悬细胞。为促进细胞膜的破裂,用Douncer玻璃匀浆器匀浆细胞5~10次,4孵育15 min。

  5. 4℃、4000 rpm离心5 min,弃上清。

  6. 细胞裂解液重新细胞核 (每3-5 x 106 个细胞加100 ul裂解液)。

  7. 冰上超声5~15 min(25%功率,超声20s、停30s),最佳超声条件需要根据预实验确定。

  8. 4℃、12000 rpm离心5 min,转移上清至新EP管中,直接进行后续试验,或冻存-20℃备用。

二、DNA断裂效果检测

  1. 取50 ul染色质上清,加入150 ul ddH2O,10 ul 5M NaCl,65 ℃ 4 h或过夜,解交联。

  2. 加入RNaseA至终浓度50 μg/ml,37 ℃孵育30 min。

  3. 加入Proteinase K至终浓度50 μg/ml,42 ℃孵育30 min。

  4. 剂盒纯化DNA片段。

  5. 1.5 %琼脂糖胶电泳检测。

三、免疫沉淀(按单个CHIP反应)

  1. 准备70 ul磁珠。

  2. 600 μl5 %BSAPBS洗涤磁珠2次。

  3. 第二次洗涤后,重悬磁珠至初始体积。

  4. 取100 ul细胞裂解物(约含20 ug 染色质,具体因细胞及制样不同而异),1:10稀释至1 ml。

  5. 取25 ul洗好的磁珠,加至细胞裂解物中,进行lysate 预吸附处理。

  6. 剩余45 ul磁珠,加入2-5 ug相应抗体,4 ℃旋转孵育过夜。(使用非特异性的IgG,作为阴性抗体对照)。

  7. 将步骤5 中样品,磁性分离,转移预吸附后的lysate至新EP管中。

  8. 用300 ul 冰预冷的 PBS(含5% BSA),洗涤步骤6后的抗体-磁珠复合物2次,弃上清。

  9. 加入预吸附后的lysate(留50 ul冻存备用)至抗体-磁珠复合物中,4 ℃旋转孵育2 h。

  10. 瞬离样品,然后置于磁力架上。

  11. 每次1 ml低盐洗涤液,洗涤2次。

  12. 每次1 ml高盐洗涤液,洗涤2次。

  13. 每次1 ml LiCl洗涤液,洗涤2次。

  14. 每次1 ml TE溶液,洗涤2次。第2次洗涤时,转移样品至新EP管中。

  15. 最后洗涤结束,移液器尽弃洗涤液。

  16. 准备Elution buffer,恒温浴调至65 ℃。

  17. 加入100 ul Elution buffer至每个样品中(步骤15后),65 ℃孵育10 min。

  18. 转移洗脱液至新EP管,并重复步骤17一次,最终收集到200 ul。

  19. 取之前预吸附后的lysate 50 ul,作为 5% Input。补加150 ul Elution buffer,至总体积200 ul。

  20. 分别向CHIP洗脱样品(步骤18后)和Input中加入10 ul NaCl(5 M 母液),65 ℃孵育过夜进行解交联。

四、DNA纯化和分析:

  1. 加入Proteinase K至终浓度50 μg/ml,42 ℃孵育1 h。

  2. 试剂盒纯化DNA片段。

  3. PCR检测及分析。

免疫荧光(Immunofluorescence, IF)染色是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。IF利用荧光标记抗体检测特异性靶抗原。染色成像非常直观,可以直接观察结果。虽然这是一个成熟的技术,但必须考虑多个因素,并采取各种优化步骤,以确保染色成功。

实验步骤:

培养细胞的免疫染色

除非另有说明,所有步骤均在室温下进行。为了获得最佳染色效果,除非使用的细胞系很脆弱(例如神经元细胞),否则应在缓慢移动的旋转摇床上进行操作。

一、固定和通透:

  1. 吸取培养基,用1X PBS(Cat No. PR20023)清洗接种在干净盖玻片上的细胞。

  2. 用新鲜的4%多聚甲醛在1X PBS中固定细胞15分钟。

  3. 用1X PBS冲洗盖玻片3次,每次3分钟。 

  4. 在1X PBS中用0.2%Triton X-100渗透5分钟。

  5. 用1X PBS冲洗盖玻片3次,每次3分钟。

二、封闭:

  1. 在1X PBS中制备5%正常血清的封闭溶液。从产生第二抗体的同一物种中选择血清,例如,如果第二抗体是山羊抗小鼠,则应选择山羊血清作为封闭液。

  2. 将细胞与封闭溶液孵育1小时(或者,如果没有相应的血清,则使用1X PBS中的3%BSA进行封闭。)

三、抗体孵育:

  1. 吸取封闭液,在抗体稀释缓冲液中稀释一抗。设置空白对照(在不加一抗的抗体稀释缓冲液中培养)。常温孵育1小时,或者,在4°C的温度下孵育过夜.

  2. 请注意:如果隔夜孵育,请采取措施确保盖玻片不会变干。

  3. 用1X PBST(Cat No. PR20024,含0.1%Tween)清洗样本3次,每次5分钟。

  4. 加入用抗体稀释缓冲液稀释的适量的荧光二抗,并在潮湿、黑暗的环境中室温孵育1小时。

  5. 请注意:加入荧光二抗后,实验样本必须尽可能保持在黑暗条件下。

  6. 用1X PBST0.1%Tween)清洗样本3次,每次5分钟。

四、封片和镜检:

  1. 用含DAPI(如果需要)的封片剂将样本封固在载玻片上。

  2. 在荧光显微镜下检查载玻片。

流式细胞技术( Flow Cytometry, FC)是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球、细菌、小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。 

 细胞胞内染色操作流程

  1. 制备单细胞悬液;

  2. PBS(Cat No. PR20023)洗涤两次后加入固定剂;
    (1)靶标在胞内时加入4%PFA固定10-20分钟后,用Flow Cytometry Perm Buffer洗涤1-2次(每次5分钟,400-600g);
    (2)靶标在核时加入Transcription Factor Staining Buffers。(固定30-60分钟,洗涤1-2次,每次5分钟,400-600g);

  3. 洗涤之后加入对应的缓冲液,重悬细胞静置10分钟;

  4. [可选]阻断Fc受体(10-20分钟);

  5. 加入抗体,2-8°C孵育(30分钟);

  6. 用对应的缓冲液洗涤1-2次(每次5分钟,400-600g);

  7. 如非荧光染料直标抗体加入荧光二抗,2-8°C孵育(30分钟);

  8. 用对应的缓冲液洗涤1-2次(每次5分钟,400-600g);

  9. [可选]细胞活性染料染色细胞;

  10. 用对应的缓冲液(或PBS)重悬细胞;

  11. 利用流式细胞仪分析细胞。

细胞表面染色操作流程

  1. 制备单细胞悬液;

  2. [可选]阻断Fc受体(10-20分钟);

  3. 加入抗体,2-8°C孵育(30分钟);

  4. 用流式细胞染色缓冲液(或PBS)洗涤(1-2x5分钟,350g);

  5. 如非荧光染料直标抗体加入荧光二抗,2-8°C孵育(30分钟);

  6. 用流式细胞染色缓冲液洗涤(1-2x5分钟,350g);

  7. [可选]细胞活性染料染色细胞;

  8. 用流式细胞染色缓冲液(或PBS)重悬细胞;

  9. 利用流式细胞仪分析细胞。

10X PBS

1000 ml

KH2PO4

2.4 g

NaH2PO4·12H2O

37.2 g

NaCl

80 g

KCL

2 g

ddH2O

1000 ml

pH

7.2-7.4

酶联免疫吸附试验( Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是目前应用最广泛的免疫学检测技术,是将抗原 - 抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合,通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度( OD 值)来反映抗原或抗体含量,灵敏度可达每毫升纳克( ng)水平甚至皮克( pg)水平。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。

目前常用的 ELISA 方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法 ELISA。此处介绍双抗夹心 ELISA 操作步骤。

ELISA实验步骤:

一、设备/材料

  • 包被液

  • ELISA洗涤液(Cat No. PR10002):

ELISA洗涤液:
19.38 mM  Na2HPO4·12H2O 69.4 g
1.8 mM  KH2PO4 2.4 g
121.24 mM  NaCl 70.9 g
0.2% Tween 20 20ml
PH7.4定容至10L
  • 封闭液(Cat No. PR10001)和稀释液(Cat No. PR10003:PBST+5%脱脂奶粉

  • 一抗

  • 酶标二抗

  • TMB显色液(Cat No. PK10004,A) :

无水乙酸钠 27.2 g
柠檬酸 3.2 g
30%过氧化氢 0.6 ml
定容至1 L
  • 1.7 TMB显色液(Cat No. PK10004,B液):

乙二胺四乙酸二钠 0.4 g
柠檬酸 1.9 g
四甲基联苯胺 0.3 g
二甲基亚砜 6 ml
甘油 100 ml
定容至1 L

 

二、操作流程

  1. 准备:

    查抗原信息找出对应的抗原,根据要检测血清和抗体的样本数量决定包被抗原的板条数,从而算出需要的包被液的数量,然后把包被液加入EP管,并做好标记,ELISA检测板条装好,并做好标记。
  2. 包被:

    根据每个抗原浓度,将抗原小样加到对应的有包被液的EP管中,使其稀释后的浓度均为3 ng/ul,稀释之后,将包被液加入相应准备好的酶标板条中,酶标孔每孔加50 ul包被液,每加完一块板盖上盖子,以免被污染,恒温37℃摇床2h或者4℃过夜。
  3. 封闭:

    取出酶标板,倒掉里面的溶液,用PBST冲一遍,摇床洗一遍(5min),拍干,用封闭液(PBS配制的5%脱脂奶粉溶液)每孔加200 ul,恒温37℃摇床1h或者4℃过夜,之后用PBST冲一遍摇床洗一遍(5 min)。
  4. 加一抗:

    按照需要将一抗做梯度稀释,100ul每孔恒温37℃孵育2小时或是4度过夜。
  5. 加二抗:

    先配制适当体积的二抗(二抗稀释度为1:100000);倒掉一抗,PBST先冲一遍,摇床洗三遍,每遍5 min,拍干。每孔加入100 ul二抗;37℃摇床1 h。
  6.  显色:

    倒掉二抗,先PBST冲一遍,摇床洗三遍,每遍5 min,拍干;戴手套,TMB A液:TMB B液=1:1配置合适体积,混匀(现配现用);每孔加100 ul,等待大约10min,蓝色比较清晰,稳定,可以读数记录,记录每条显色的孔数。

抗原亲和纯化(Affinity-Purification )是基于抗原 - 抗体可逆结合的特性产生的一种纯化免疫球蛋白的方法,通过交联到树脂上的抗原,纯化出与抗原有特异性反应的抗体,这一纯化方法大量的去除了非特异性的免疫球蛋白成分,得到的抗体特异性更高。  

抗原亲和柱制备

一、物料和试剂

  • CNBr-activated Sepharase 4B,GE Healthcare

  • 1mM HCL

  • 1L连接缓冲液

100mM NaHCO3 8.4 g
500mM NaCl 29.2 g
加ddH2O至1L
  • 封闭液: 0.5M 乙醇胺,0.5M NaCl pH 8.0

  • pH4.0洗涤液:

0.5M NaCl 19.22 g
加ddH2O至1L,加醋酸调pH至4.0
  • pH8.0洗涤液:

0.1M Tris 121.1 g
加ddH2O至1L,加盐酸调PH至8.0
  • PBS缓冲液(Cat No. PR20023):

10mM Na2HPO4·12H2O 3.58 g
1.8mM KH2PO4 0.24 g
137mM NaCl 8 g
2.7mM KCl 0.2 g
pH 7.4,加ddH2O至定容至1L

二、操作流程

  1. 预处理 CNBr-activated Sepharase 4B:称取适量 CNBr-activated Sepharase 4B干粉( 1mg冻干粉可得到3.5mlbeads,通常1mlbeads能结合5-10mg蛋白),放入预冷1mM HCL的烧杯中置于4度15分钟。等体积分装beads于亲和纯化柱中,按照1ml beads 200ml1mM HCL洗涤。然后抽干残留HCL。

  2. 将溶解处理好的蛋白或是多肽加入适量coupling buffer,然后加入装有beads的纯化柱。同时在两种条件下孵育:室温孵育3-4小时,4度孵育过夜。

  3. 孵育结束后用coupling buffer洗涤连接好的beads3次,然后加入封闭液,1mlbeads加8ml封闭液。4度过夜或是室温4小时。

  4. 流出封闭液,用coupling buffer洗涤3次后,分别用PH4.0和PH8.0的酸碱交替洗涤3次。

  5. 洗好的beads加入20%乙醇的PBS放4度备用。

 亲和纯化步骤

一、物料和试剂

  • PBS缓冲液:

19.38mM Na2HPO4·12H2O 69.4 g
1.8mM KH2PO4 2.4 g
121.24mM NaCl 70.9 g
调pH至7.84,定容至10 L
  • 磷酸中和液:

Na2HPO4·12H2O 322.3 g
KH2PO4 4.9 g
加水定容至1 L
  • 洗脱液:

150mM NaCl 87.6 g
HCL调pH至2.0-2.5, 定容至10 L
  • 考马斯亮蓝:100mg 考马斯G-250,50ml 乙醇,100ml 磷酸。

二、操作流程

  1. 4解冻血清后,浸入56度水浴锅30分钟,保证血清液面在水浴里面。

  2. 4,3500rpm,离心20分钟。

  3. 用移液器将离心好的血清表面的脂类吸出,取上清,留30-50ul血清小样ELISA检测。

  4. 将准备好的柱子和血清进行孵育,室温1.5小时,室温低时可置于30水浴锅。

  5. 孵育完成后用PBS洗涤3次,每次10倍柱体积。

  6. 洗脱:用pH5.0的150 mM甘氨酸预洗脱5-10ml,再用预冷的pH2.5洗脱液洗脱,每次收集1ml,EP管或是96孔收集板中预先加入50ul中和液。

  7. 将收集液用考马斯检测收集峰,100 ul考马斯中加入3.3 ul收集液,并根据收集峰判断直接收集和需要浓缩的抗体,并分开保存。

  8. 考马斯检测没有颜色的时候终止收集,用10 mlPBS洗涤,然后重复孵育洗脱直到没有收集峰出现。取50 ul FT留样做ELISA 。

  9. 将收集的低浓度抗体用PEG浓缩或是ProA浓缩。

  10. 按要求保存抗体.

  1. 将菌体用30-35 ml PBST (Cat No. PR20024)悬浮;

  2. 冰浴超声:300W, 2s, 2s, 6 min;

  3. 破碎后离心:12000rpm,15 min,4℃;

  4. 将沉淀用30 ml wash buffer重悬,添加200 ul (100 mM)PMSF ,60 ul (2 M)DTT;

  5. 冰浴超声:300 W, 2s, 2s, 3min;

  6. 室温振荡洗涤1h;

  7. 离心:10000 rpm, 10 min,4℃;

  8. 沉淀再用15ml wash buffer 重悬,冰浴超声:300W,2s,2s,1min;

  9. 室温振荡洗涤1h;

  10. 用10ml的 EP管 离心:10000rpm,10min,4℃;

  11. 沉淀用纯水清洗。

  12. 根据蛋白用途,再加入适当体积的溶解液,重悬沉淀,4℃振荡过夜溶解:

    注射用:8M Urea pH 8.0

    纯化用:2% SKL pH 8.0

     

     

  13. 次日离心:10000rpm,10min,4℃,制样跑胶。