RIPA裂解液(中)

Cat No : PR20001

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产品介绍

Proteintech开发的RIPA裂解液(中)是一款裂解强度中度的裂解液,可用于从细胞、组织中制备非变性蛋白裂解物。可以用于Western Blot、IP、Co-IP、ELISA等实验。RIPA裂解液(中)主要成分为Tris (pH 7.4) ,  NaCl ,  Triton X-100,Sodium Deoxycholate,SDS,NaF,EDTA-2Na等。推荐用于Western Blot细胞样品和IP样品制备首选。


组分液体
RIPA裂解液(中)50 mL


保存条件

4℃保存,一年有效。


使用方法

1. 对于细胞样品

取适当量的裂解液,使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂混合液(货号:PR20032 / PR20016),用于磷酸化相关检测需要添加磷酸酶抑制剂混合液(货号:PR20015)。

a. 瓶内裂解法(效果最佳):适用于所有的贴壁细胞

(1)吸净培养基,用预冷的PBS清洗细胞表面2遍(动作轻柔,防止细胞脱落),尽可能吸取残留的PBS。

(2)在冰上按每1000万细胞加入1 mL预冷的裂解液(裂解液在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物)于细胞瓶、培养板或培养皿中,用移液管吹散贴壁的细胞,对于贴壁紧的细胞也可使用细胞刮收集,收集裂解液,在冰上放置30 min,期间每10 min上下颠倒混匀一次。

b. 离心法:适用于悬浮细胞和药物处理过的细胞

(1)使用细胞刮收集细胞悬液(连同培养基一起收集),4℃,500 g离心5 min,收集沉淀,沉淀用预冷的PBS洗涤两遍,收集细胞沉淀,尽可能吸取残留的PBS。

(2)按每1000万细胞加入1 mL预冷的裂解液,在冰上放置30 min,期间每10 min上下颠倒混匀一次。

注意:

(1)细胞的收集优先使用瓶内裂解法处理,瓶内裂解法可以有效的防止细胞在离心过程中破碎,能有效地提高总蛋白得率,同时也能保留细胞外基质(ECM)。

(2)对于药物处理过的贴壁细胞则推荐使用离心法收集,因为药物处理过的细胞往往贴壁不牢,在PBS清洗阶段容易丢失。

(3)一些细胞粘度高(HEK-293)和密度高的悬浮细胞(Jurkat、K-562等)在加入细胞裂解液后容易形成絮状物,此时应及时的使用超声破碎仪将其打散。

(4)用于 Western Blot、IP、ELISA 等实验的样品推荐使用超声波对样品进行辅助破碎,用于Co-IP的样品尽量避免使用超声处理样本。

2. 对于动物组织样品

取适当量的裂解液,使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂混合液(货号:PR20032 PR20016),用于磷酸化相关检测需要添加磷酸酶抑制剂混合液(货号:PR20015)。取新鲜的动物组织,用预冷的PBS洗净组织块上附着的脂肪和血液等杂质,用滤纸吸干水分后称重。

a. 液氮研磨法:将剪碎的组织块在研钵中加入液氮,快速研磨至细粉状,转移至EP管中,按每100 mg组织加1 mL预冷的裂解液,使用移液器上下吹打混匀,直至完全溶解。

b. 冷冻研磨机法:提前开启冷冻研磨机预冷,将吸干水分的组织样本剪成1-2 mm左右的小块,按照每管100 mg分装到2 mL离心管,同时每管加入1粒5 mm的研磨珠。将离心管和适配器放入液氮里浸泡速冻。将离心管和适配器转移到冷冻研磨机,使用65HZ研磨45秒,如果研磨效果不理想可中断15秒后重复研磨一次。每管加1 mL预冷的裂解液,使用移液器上下吹打混匀,直至完全溶解。

c. 匀浆法:在离心管中将组织块剪碎,然后在冰上,按每100 mg组织加1 mL预冷的裂解液。将样品转移到合适大小的预冷玻璃匀浆器中,在冰浴条件下对样品匀浆30-50次至充分裂解。

鉴定方法:取20 μL匀浆30次后的组织样品加入等体积的0.4%台盼蓝溶液,混匀,在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性(蓝色)细胞数目的比例,当阳性(蓝色)细胞破碎达到100%即说明裂解充分。 若阳性(蓝色)细胞比例未达到100%,适当增加匀浆次数,随后按照同样的方法使用台盼蓝溶液进行鉴定。

 注意:

(1)优先推荐选用液氮研磨法和冷冻研磨机法,其破碎效果最佳;其次推荐使用匀浆法,匀浆法易产生热量,加快降解。

(2)使用冷冻研磨机法对液氮速冻过的样本进行破碎,对离心管的材质要求比较高,需选用专用的离心管。

(3)用于 Western Blot、IP、ELISA 等实验的样品推荐使用超声波对样品进行辅助破碎,用于Co-IP的样品尽量避免使用超声处理样本。

3. 对于植物、细菌等其它类型样本:具体步骤请参照文献或资料中特定样本相应的通用操作进行。


注意

1. 需自备蛋白酶抑制剂混合液(货号:PR20032 / PR20016)和磷酸酶抑制剂混合液(货号:  PR20015)。

2. 不同的样品之间蛋白含量存在差异,可根据实际样品调整加入的裂解液体积。

3. 提取得到的总蛋白可以使用Proteintech的BCA蛋白浓度检测试剂盒(货号:PK10026)测定蛋白浓度,不适用Bradford法测蛋白浓度。

4. 裂解产物中可能会出现一小团透明胶状物,为含有基因组DNA等的复合物。在低温的条件下,用超声处理打碎打断该透明胶状物,随后10000 g离心取上清用于后续实验。

5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

6. 本产品仅用于科研,不得用于临床诊断或治疗。


附录1:Proteintech各种裂解液的特点

附录1:Proteintech各种裂解液的特点.jpg

附录2:Proteintech各种裂解液的选择

附录2:Proteintech各种裂解液的选择.jpg

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