蛋白G琼脂糖珠

使用方法

使用本产品前，先确认一抗种属和亚型，参考下表确认本产品与之兼容。如不确定亚型，也可考虑Protein A/G beads（货号：PR40025），其结合能力参考页面详情介绍。

免疫沉淀

方式一（SDS Sample buffer洗脱法）

1. 用预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer裂解细胞或组织。取1-3 mg总蛋白的裂解物（体积控制在200-400 uL），加入1-4 ug特异性抗体以及 150-300 uL Incubation buffer。4℃旋转过夜。

2.  吸取等量蛋白裂解物，加入等量Incubation buffer并加入同种属等量的IgG孵育作为Control IgG对照组。4℃旋转过夜。                                                                               

3.  加入80-100 uL重悬的 Protein G beads（预先用PBS低速离心洗涤3次），4℃ 旋转孵育1-4 h。

4.  用1 × Washing buffer（现加蛋白酶抑制剂）洗涤沉淀复合物,4℃ 500 g离心30 s，弃上清，重复洗涤5次。 最后一次洗涤后留约80 uL Washing buffer。

5.  加入20 uL 5 × Sample Buffer，重悬IP复合物beads，沸水浴加热5 min。

6.  8000 g-10000 g离心3 min，小心吸取上清转入新的EP管中。取20-40 uL样品进行免疫印迹检测，设置Control IgG对照和Input对照。

方式二（酸洗法）

1. 用预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer裂解细胞或组织。取1-3 mg总蛋白的裂解物200-400 uL，加入下端带有堵帽的纯化柱中，同时加入1-4 ug特异性抗体以及 150-300 uL Incubation buffer。4℃旋转过夜。

2. 吸取等量蛋白裂解物，加入等量Incubation buffer并加入同种属等量的IgG孵育作为Control IgG对照组。4℃旋转过夜。                                                                         

3. 向纯化柱中加入80-100 uL重悬的 Protein G beads（已预先用PBS低速离心洗涤3次）, 4℃旋转孵育1-4 h。

4. 打开纯化柱末端堵帽，将上清自然流出弃除。用1 x Washing buffer（现加蛋白酶抑制剂）洗涤沉淀复合物5次。洗涤结束后，将纯化柱置入收集管中 4℃ 500g离心30s，弃收集管以及离心产物。

5. 用堵帽堵住纯化柱下端出液口，向纯化柱中加入80 uL Elution buffer，盖上盖子，室温静置5-10 min，期间可以轻轻摇晃2-3次，重悬沉淀复合物，以达到更好的洗脱效果。洗脱完成，取下堵帽，将纯化柱置入新的离心管，4 ℃ 8000-10000 g 离心 1 min 收集产物。

6. 向洗脱产物中加入10 uL 碱中和液以及23 uL 5 x Sample Buffer，沸水浴加热5 min。

7.  取20-40 uL样品进行免疫印迹检测，设置Control IgG对照和Input对照。

参考配方：

抗体纯化

1. 根据抗体的亚型确定填料的种类。对于IgG1亚型的小鼠单抗一般采用Protein G beads纯化，对于兔IgG类单抗、小鼠IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3亚型的抗体、兔和鼠来源的多抗可采用Protein A beads（货号：PR40023）纯化。其他亚型的抗体参考上面的结合特性表选用填料。

2. 填料的预处理。根据粗原料中抗体抗体以及纯化规模大致估计所需要的填料体积，摇匀本产品后立即取出所需体积的填料。用填料30倍体积的PBS洗涤以去除保存液。洗涤可以在纯化柱中进行，也可以用离心管进行1000ｇ离心洗涤（每轮离心5-10分钟）。

3. 粗原料的处理。为了得到高纯度的产品，同时让填料发挥最大性能，粗原料要求清澄均匀，待纯化的粗原料可以用0.2 um膜过滤或10000g离心10分钟以去除不溶成份。如果粗原料是动物腹水或抗血清，澄清后用PBS稀释２-３倍后再进行下一步可以有效降低非特异性结合。

4. 抗体的结合。结合可以用静态法，也可以用动态法。

静态法：将待纯化的粗原料与填料混合（可以用瓶子或离心管盛装），密封好后在旋转器上旋转反应，反应可以在室温或37℃进行2-4小时，也可以4℃过夜反应。反应结束后1000ｇ离心5-10分钟分离填料和上清（流穿液）。

动态法：将填料装在空的层析柱中，接至纯化仪或蠕动泵上，再使粗原料反复流经纯化柱进行结合反应，反应可以在室温或37℃进行2-4小时，也可以4℃过夜反应。反应结束后放出管路和层析柱中液体（流穿液）。

5. 杂质的洗涤。用30倍填料体积的PBS洗涤填料以去除非特异结合以及未结合的杂质。操作同第２步。

6. 抗体的洗脱。将填料转移至合适大小的层析柱内，转移后填料高度为1-5cm为宜。用洗脱液洗脱，洗脱液可以用pH 2.0-2.5 0.2M Glycine, 也可以用pH 2.0-2.5 HCl + 150mM NaCl。洗脱过程可以连续洗脱也可以用不连续洗脱。用UV法或其他快速定量方法判断洗脱峰。

7. 抗体的保存。洗脱下来的抗体立即用1M Tris或饱和磷酸氢二钠中和至中性。注意中和完后可能部份抗体在等电点处沉淀形成浑浊，此时可以将pH调至8.0左右 使之溶解。 最后终产品于-80℃长期保存，为了减少反复冻融可以适当分装。 也可以加甘油和防腐剂后于-20℃保存。

8. 填料重生和保存。纯化后的填料可以用酸碱交替洗涤各30倍柱体积，最后用PBS洗涤至中性，4度保存在20％乙醇中。