蛋白G琼脂糖珠

Cat No : PR40024



产品介绍

Protein G是链球菌表面的一种细胞壁蛋白,可以结合哺乳动物免疫球蛋白部份亚型的Fc区,本产品是偶联有重组Protein G的beads,具有高结合力,高载量的特点,可应用于免疫沉淀/免疫共沉淀实验以及抗体的纯化。


指标

性能

基质

高度交联的4%琼脂糖微球

配体

重组蛋白G

载量

>30mg 人lgG/ml微球(干体积)

粒径 (μm)

45-165

最大压力

0.3 MPa, 3 bar

pH 稳定范围

3-10

储存缓冲液

含20% 乙醇的1×PBS

储存温度

2℃-8℃

保存条件

beads保存在含20%乙醇的PBS中,2℃-8℃保存。不可低于0℃保存。

使用方法

使用本产品前,先确认一抗种属和亚型,参考下表确认本产品与之兼容。如不确定亚型,也可考虑Protein A/G beads(货号:PR40025),其结合能力取下表中每行结合能力强的。

种属

亚型

Protein A 结合力

Protein G 结合力

Human

IgA

varible

IgD

IgE

IgG1

++++

++++

IgG2

++++

++++

IgG3

++++

IgG4

++++

++++

IgM

varible

Avian egg yolk

IgY

Cow


++

++++

Dog


++

+

Goat


++

Guinea pig

IgG1

++++

++

IgG2

++++

++

Hamster


+

++

Horse


++

++++

Koala


+

Llama


+

Monkey(rhesus)


++++

++++

Mouse

IgG1

+

++++

IgG2a

++++

++++

IgG2b

+++

+++

IgG3

++

+++

IgM

variable

Pig


+++

+++

Rabbit

no distinction

++++

+++

Rat

IgG1

+

IgG2a

++++

IgG2b

++

IgG3

+

++

Sheep


+/-

++

 

 

免疫沉淀

方式一(SDS Sample buffer洗脱法)

1. 用预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer裂解细胞或组织。取1-3 mg总蛋白的裂解物(体积控制在200-400 μL),加入1-4 μg特异性抗体以及 150-300 μL Incubation buffer。4℃旋转过夜。

2.  吸取等量蛋白裂解物,加入等量Incubation buffer并加入同种属等量的IgG孵育作为Control IgG对照组。4℃旋转过夜。                                                                                                                                                                                                                        

3.  加入80-100 μL重悬的 Protein G beads(预先用PBS低速离心洗涤3次),4℃ 旋转孵育1-4 h。

4.  用1 × Washing buffer(现加蛋白酶抑制剂)洗涤沉淀复合物,4℃ 500 g离心30 s,弃上清,重复洗涤5次。 最后一次洗涤后留约80 μL Washing buffer。

5.  加入20 μL 5 × Sample Buffer,重悬IP复合物beads,沸水浴加热5 min。

6.  8000 g-10000 g离心3 min,小心吸取上清转入新的EP管中。取20-40 μL样品进行免疫印迹检测,设置Control IgG对照和Input对照。

 

方式二(酸洗法)

1. 用预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer裂解细胞或组织。取1-3 mg总蛋白的裂解物200-400 μL,加入下端带有堵帽的纯化柱中,同时加入1-4 μg特异性抗体以及 150-300 μL Incubation buffer。4℃旋转过夜。

2. 吸取等量蛋白裂解物,加入等量Incubation buffer并加入同种属等量的IgG孵育作为Control IgG对照组。4℃旋转过夜。                                                                                                                                                                                                                        

3. 向纯化柱中加入80-100 μL重悬的 Protein G beads(已预先用PBS低速离心洗涤3次), 4℃旋转孵育1-4 h。

4. 打开纯化柱末端堵帽,将上清自然流出弃除。用1 x Washing buffer(现加蛋白酶抑制剂)洗涤沉淀复合物5次。洗涤结束后,将纯化柱置入收集管中 4℃ 500g离心30s,弃收集管以及离心产物。

5. 将纯化柱柱置入新的离心管中以收集洗脱产物,用40 μL洗脱液洗脱沉淀复合物,室温静置5-10 min,并在4℃ 8000-10000g离心1 min, 取新的40 μL Elution buffer重复洗脱一次(2次洗脱合并收集)。

6. 向全部洗脱产物中加入10 μL 碱中和液以及23 μL 5 x Sample Buffer,沸水浴加热5 min。

7.  取20-40 μL样品进行免疫印迹检测,设置Control IgG对照和Input对照。

 

参考配方:

RIPA裂解液                

配制:1000 ml                

Tris

6 g

NaCl

8.76 g

脱氧胆酸钠

5 g

SDS

1 g

NaF

0.42 g

EDTA.2Na.2HO

1.86 g

Triton X-100

10 ml

盐酸调pH至7.4,补ddHO定容至1000 ml,4°C保存

注:PMSF及其它蛋白酶抑制剂现用现加


5X SDS sample buffer                

配制;50 ml                

Tris HCl (1M母液,pH 7.0)

12.5 ml

甘油

17.5 ml

SDS

7.5 g

溴酚蓝

15 mg

补ddH2O至37.5 ml,分装并保存在-20°C

现用现加还原剂:25% DTT(2M母液)


Incubation buffer                

配制:1000 ml                

KCl

0.2 g

KH2PO4                

0.2 g

Na2HPO4·12H2O

1.14 g

NaCl

8 g

NaF

0.42 g

EDTA.2Na.2H2O

1.86 g

盐酸调pH至7.4,补ddH₂O定容至1000 ml,4°C保存


Washing buffer(1 x TBST)                

配制:1000 ml                

Tris

2.42 g

NaCl

8.76 g

KCl

0.373 g

Tween-20

2 ml

盐酸调pH至7.4,补ddH₂O定容至1000 ml


洗脱液(Elution buffer)                

配制:500 ml                

NaCl

14.6 g

Glycine

5.625 g

调pH至1.5-2.0,补ddH₂O定容至500 ml,4°C保存


碱中和液(Alkali neutralization buffer)                

NaOH溶液

0.9 M~1.3 M

The final concentration is adjusted addcording to Elution buffer


抗体纯化

1. 根据抗体的亚型确定填料的种类。对于IgG1亚型的小鼠单抗一般采用Protein G beads纯化,对于兔IgG类单抗、小鼠IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3亚型的抗体、兔和鼠来源的多抗可采用Protein A beads(货号:PR40023)纯化。其他亚型的抗体参考上面的结合特性表选用填料。

2. 填料的预处理。根据粗原料中抗体抗体以及纯化规模大致估计所需要的填料体积,摇匀本产品后立即取出所需体积的填料。用填料30倍体积的PBS洗涤以去除保存液。洗涤可以在纯化柱中进行,也可以用离心管进行1000g离心洗涤(每轮离心5-10分钟)。

3. 粗原料的处理。为了得到高纯度的产品,同时让填料发挥最大性能,粗原料要求清澄均匀,待纯化的粗原料可以用0.2μm膜过滤或10000g离心10分钟以去除不溶成份。如果粗原料是动物腹水或抗血清,澄清后用PBS稀释2-3倍后再进行下一步可以有效降低非特异性结合。

4. 抗体的结合。结合可以用静态法,也可以用动态法。

静态法:将待纯化的粗原料与填料混合(可以用瓶子或离心管盛装),密封好后在旋转器上旋转反应,反应可以在室温或37℃进行2-4小时,也可以4℃过夜反应。反应结束后1000g离心5-10分钟分离填料和上清(流穿液)。

动态法:将填料装在空的层析柱中,接至纯化仪或蠕动泵上,再使粗原料反复流经纯化柱进行结合反应,反应可以在室温或37℃进行2-4小时,也可以4℃过夜反应。反应结束后放出管路和层析柱中液体(流穿液)。

5. 杂质的洗涤。用30倍填料体积的PBS洗涤填料以去除非特异结合以及未结合的杂质。操作同第2步。

6. 抗体的洗脱。将填料转移至合适大小的层析柱内,转移后填料高度为1-5cm为宜。用洗脱液洗脱,洗脱液可以用pH 2.0-2.5 0.2M Glycine, 也可以用pH 2.0-2.5 HCl + 150mM NaCl。洗脱过程可以连续洗脱也可以用不连续洗脱。用UV法或其他快速定量方法判断洗脱峰。

7. 抗体的保存。洗脱下来的抗体立即用1M Tris或饱和磷酸氢二钠中和至中性。注意中和完后可能部份抗体在等电点处沉淀形成浑浊,此时可以将pH调至8.0左右 使之溶解。 最后终产品于-80℃长期保存,为了减少反复冻融可以适当分装。 也可以加甘油和防腐剂后于-20℃保存。

8. 填料重生和保存。纯化后的填料可以用酸碱交替洗涤各30倍柱体积,最后用PBS洗涤至中性,4度保存在20%乙醇中。

Publications

ApplicationTitle

Biochem Pharmacol

The orphan GPR50 receptor interacting with TβRI induces G1/S-phase cell cycle arrest via Smad3-p27/p21 in BRL-3A cells.

Authors - Cuifang Chang