超敏ECL化学发光检测试剂盒

Cat No : PK10003



产品介绍

Proteintech 研发的超敏ECL 化学发光检测试剂盒是免疫印迹实验中与辣根过氧化物酶(HRP)配套使用的底物检测试剂盒。本产品能够在HRP 的催化下发生化学反应而发光,可用于检测固定在膜上的蛋白质等生物大分子,由于使用了两种新的增强剂混合协同增强发光,其高灵敏度能够检测低pg 级别的抗原,发光信号更强烈持久,使用照相技术(X-光胶片曝光)或者其他成像方法(如荧光或化学发光成像仪)进行检测。

组分100 mL
200 mL500 mL
A液50 mL100 ml250 mL
B液50 mL100 ml250 mL


保存条件

4 ℃密封避光保存,一年有效。

使用方法

1. Western 二抗孵育后,印迹膜经过数次充分洗涤后,用平头镊将膜取出,用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白质),然后置于一洁净器皿内或是保鲜膜上。

2. 根据印迹膜大小,将A 液与B 液等体积混合,配制为发光检测底物工作液(使用量约为每10cm2 膜1mL 或者根据个人实验习惯使用)。滴加发光底物工作液到印迹膜上,确保工作液均匀覆盖在膜上,放置1-2 分钟。

3. 取膜,弃发光底物工作液,用吸水纸略吸去过多的液体,将膜放置于两片洁净保鲜膜中间,此过程应小心完成,避免膜与膜之间产生气泡。随后进行压片检测或是荧光成像仪检测。

4. 压片检测:将膜固定于片夹内,暗室内压片1 分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间。或直接分别压片30秒,1,3,5 分钟,然后一起显影定影观察结果。

5. 荧光成像仪检测:将膜放置到荧光成像仪内,参照仪器说明书进行检测。

注意

1. 为获得最佳实验结果,请务必优化实验条件,包括检测样品的用量、一抗和二抗稀释度、杂交膜及封闭试剂的选择。

2. 务必使用推荐的抗体稀释浓度以获得阳性结果,最佳抗原和抗体用量须通过预实验来确定。

3. 由于奶粉中含有内源性生物素,在使用亲和素/生物素系统时,封闭液中应避免使用奶粉。

4. 由于叠氮钠是HRP 抑制剂,在缓冲液中应避免使用叠氮钠作为防腐剂。

5. 在与膜发生接触过程中,请佩戴手套且使用干净镊子等洁净器材,避免蛋白污染及高背景。

6. A 液和B 液在吸取过程中必须要更换枪头,A 液和B 液相互污染后会导致A 液或B 液逐渐失效,影响后续的使用效果。A 液与B 液混合后须尽快使用,放置过久会影响灵敏度。

7. 各溶液使用后,请盖紧瓶盖避光保存,以防失效。特别是B 液,含有氧化剂,比较容易被还原而失效。

8. A 液和B 液均对人体有害,操作时请注意适当防护。为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


问题解答:

问题可能原因解决办法

高背景(背景高或无特异性蛋白带)

一抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度使用推荐的封闭液和TBS/T 稀释抗体并4℃孵育过夜
化学发光检测时没有使用相应的膜使用高质量的NC 膜或PVDF 膜

膜封闭不足导致一抗或二抗产生大量的非特异性结合

用含5%脱脂奶粉的TBS/T 在室温封闭1-2 小时

二抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度,或二抗的特异性差

一些二抗会与蛋白产生非特异性的结合。因此在检测中可加入一步二抗的对照试验,在没有一抗的情况下,直接加入二抗孵育。也可将二抗用含5%脱脂奶粉的TBS/T 在室温下孵育1 小时

配制试剂的用水水质不佳

在配制试剂时(尤其是磷酸化抗体)使用Milli-Q 或其它超纯的去离子水

信号弱(检测不到信号)一抗孵育不足适当延长孵育时间(4℃孵育过夜)
转膜不完全

转膜时采用更高的电压和更长的时间。也可采用预染的蛋白Marker 监控转膜的过程

封闭膜超时

缩短封闭膜的时间

蛋白的表达水平低于检测底限

在每孔中加入更多的蛋白;

采用免疫沉淀法富集蛋白;

换用表达高的样本或细胞;

检测前适当刺激蛋白的表达

二抗与一抗的结合率太低提高二抗的浓度或换用与一抗匹配的二抗
配制试剂时发生交叉污染重新配制各种试剂


Publications

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