Western Blot大分子蛋白指南

在Western Blot实验中，我们通常接触到的目的蛋白的分子量基本在200KDa以下，市面上常见的蛋白Marker的指示范围也在10-200KDa。 如果我们所研究的靶标蛋白超过200KDa，该如何通过Western Blot检测呢？

  大分子WB疑难解析

做大分子WB检测，我们首先得弄明白：大分子WB的难点在哪里？

难点就在：大分子蛋白质的完整性容易被破坏。

可以从凝胶体系和蛋白样品制备这两个方面去改进

1、凝胶体系

我们目前使用的WB以Laemmli凝胶体系为主，Laemmli凝胶体系的优点我们就不必过多说明，关键是它的缺点大家是否了解？

（a）Laemmli凝胶的分离胶高pH值（8.8）,易造成蛋白质碱性降解，如脱氨基作用等； （b）在Laemmli凝胶体系中含有半胱氨酸的蛋白质的氧化还原状态并不稳定； （c）Laemmli凝胶体系的制样过程中加入SDS sample buffer后，100℃煮样会造成ASP-Pro键断裂①。

由此可见Laemmli凝胶体系对大分子蛋白质完整性的保护是“极不友好”的，所以凝胶体系需要改变。

那到底哪种凝胶体系更加适合大分子WB检测呢？

其实早在十几年前，免疫学的科学家们就提出了Tris-Acetate凝胶体系用于大分子WB的检测，Tris-Acetate凝胶体系的中性pH值（7.0）完美的避开上述Laemmli凝胶体系的缺点，最大程度的保持大分子蛋白质的完整性。

为了验证Tris-Acetate凝胶体系的可靠性，严谨的Proteintech科研人员做了各种实验对比，结果如下图：

通过上述实验结果，可以很清晰地看到，Hela样品在Tris-glycine凝胶中150KDa以上的条带很少且模糊，尤其是250KDa以上基本看不到任何条带； 而反观Tris-Acetate凝胶中150KDa以上的条带非常的清晰、锐利。

2、蛋白样品制备

选择了合适的凝胶体系，接下来的关键步骤就在蛋白样品制备上了。 裂解液的裂解强度对大分子蛋白质的完整性起到决定的作用，我们可以通过一张跑胶图片来分析：

上图中是使用三种不同裂解强度的裂解液分别制备的mouse skeletal muscle的总蛋白样品，裂解液强度依次为Lane1（很强） >Lane2（中等）>Lane3（温和）。

我们仔细观察100KDa以上的蛋白条带可以发现在一定范围内裂解液的强度越温和时，100KDa以上的大分子蛋白条带会更多、更清晰。 这是为什么呢？

可能存在的原因有：（1）当裂解液越强时，对蛋白质的溶解能力就越强，含量高的蛋白质溶解的就越多，后续对蛋白样品进行定量后，点样相同量的总蛋白时含量低的大分子蛋白质上样量就更低了； （2）当裂解液强时，大分子蛋白质容易被解聚，从而导致条带少。

为了避免大分子蛋白质的完整性在样品制备环节中被破坏，我们可以做以下三点改变：

（1）使用裂解能力温和的裂解液。如RIPA裂解液（中）、RIPA裂解液（弱）、Co-IP裂解液等，对于500KDa以上的大分子蛋白质检测甚至可以使用比上述裂解液更温和的CHAPS裂解液（配方见下文）。当然需要引起我们注意的是裂解液越温和溶解性越差，我们需要结合待测靶蛋白选用合适的裂解液。

（2）使用LDS-PAGE蛋白上样缓冲液。相比于的SDS，LDS不仅具有SDS相同的变性能力，还更加利于维持蛋白质的完整性。

（3）70℃水浴10分钟代替100℃煮样5分钟。70℃水浴可以有效的避免蛋白质ASP-Pro键断裂。

注：以上提供的只是大分子蛋白样品制备的最佳方案，并非常规SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制样方式就一定不能用于大分子检测。

  大分子WB检测方案

一、样品制备

1. 根据下图配制CHAPS裂解液和LDS-PAGE蛋白上样缓冲液（4X）。

2. 细胞样品处理

a、瓶内裂解法（效果最佳）：适用于所有的贴壁细胞

吸净培养基，用预冷的PBS清洗细胞表面2遍（动作轻柔，防止细胞脱落），尽可能吸取残留的PBS。在冰上按每1000万细胞加入1mL预冷的CHAPS裂解液于细胞瓶、培养板或培养皿中，用移液管吹散贴壁的细胞，对于贴壁紧的细胞也可使用细胞刮收集，收集裂解液，4℃冰箱或冰盒中摇晃30分钟，使其充分裂解。

b、离心法：适用于悬浮细胞和药物处理过的细胞

使用细胞刮收集细胞悬液（连同培养基一起收集），4℃，500 xg离心5分钟，收集沉淀，沉淀用预冷的PBS洗涤两遍，收集细胞沉淀，尽可能吸取残留的PBS。按每1000万细胞加入1mL预冷的CHAPS裂解液，4℃冰箱或冰盒中摇晃30分钟。

3. 动物组织样品：

取新鲜的动物组织，用预冷的PBS洗净组织块上附着的脂肪和血液等杂质，用滤纸吸干水分后称重。在离心管中将组织块剪碎，然后在冰上，按每100mg组织加1mL预冷的CHAPS裂解液。将样品转移到合适大小的预冷玻璃匀浆器中，在冰浴条件下对样品匀浆10-20次至充分裂解，收集匀浆液，4℃冰箱或冰盒中摇晃30分钟，使其充分裂解。

4. 4℃,15000xg离心15分钟，收集上清样品。

5. 使用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，将样品分装成小份，同时每管按3:1加入LDS-PAGE蛋白上样缓冲液（4X），使样品中LDS-PAGE蛋白上样缓冲液的终浓度为1X，上下颠倒混匀，保存在-80℃冰箱。

6. 使用前室温解冻，每管补加新鲜的2M DTT溶液至终浓度为100mM，混匀，70℃水浴10分钟。

注：（1）不要对样品进行超声破碎；（2）解冻后的样品在2个小时内使用完；（3）样品不要反复冻融。

二、制梯度胶

（1）根据下图配制3M Gel buffer(15X)和40%Gel(37.5:1)。

（2）按配方配制两种不同浓度的Tris-Acetate胶，使用梯度胶灌胶器先灌20mL 3%低浓度的Tris-Acetate胶，然后再将剩余的两种不同浓度的Tris-Acetate胶加入相应的梯度混匀仪杯体中，打开梯度混匀仪杯体的连通阀门开关进行梯度胶灌制，灌至小玻璃上边缘结束灌入，并插入梳子。

（3）室温水平静置2小时，直至醋酸胶完全凝固即可拔出梳子进行跑胶。

Tips：

（1）常用的Tris-glycine胶体系所用的胶母液C%值通常为3，而用于大分子检测的Tris-Acetate胶的胶母液C%值可以适当的降到2.6，这样可以让大分子的蛋白质完全进入凝胶中，避免堵塞在进样口。C%=Bisacrycrylamide/(Bisacrycrylamide+Acrycrylamide)*100%

（2）为让大分子蛋白完全进入凝胶，我们先灌制了2.5-3cm的3%的胶，然后再灌梯度胶。

（3）APS和TEMED应在浇注凝胶之前最后加入。APS溶液应新鲜制备，以确保凝胶具有良好的分辨率。

三、跑胶

1. 根据下图配制1X Running buffer。

2. 将梯度胶玻璃板上的残胶冲洗干净，放置在电泳槽中，加入1×Running buffer，将整个电泳槽放入冰水浴中,将标准品和蛋白样品加入胶的点样孔中，使用130v电压电泳，直至蓝色指示线跑出胶后结束电泳。

Tips：

3-8%的Tris-Acetate梯度胶在冰水浴中使用130v电压电泳通常90分钟指示剂可以完全跑出胶，此时凝胶最下面的Marker为50KDa左右，如需检测200KDa以上的目的带，可以在指示剂完全跑出胶后接着电泳30分钟（即总电泳时长2h），这样最下面的Marker为90KDa左右,200KDa以上的大分子蛋白质会拉的更开。

四、转膜

1. 根据下图配制1X Transfer buffer。

2. 将胶从电泳槽中取出，浸泡在转移缓冲液中，以海绵/滤纸/膜/胶/滤纸/海绵的方式，将其紧密排列，确保各个夹层之间没有气泡，采用20V恒压进行湿法转移过夜，保持整个转移仪在冰水浴中。

Tips：

转膜时不要将凝胶的上部分切掉，因为凝胶的上部分会有分子量较大的蛋白；强烈推荐过夜转移，过夜转移效率最佳。

五、免疫印迹

转移完成后，将膜取出，使用封闭液在37℃水平恒温摇床中封闭1小时，即可用于后续的免疫印迹实验，后续的免疫印迹实验与常规Laemmli凝胶体系步骤相同。

PTG-Lab免疫学实验常用试剂（点击跳转）