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Product Information
利用抗原抗体亲和结合的特性，免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP） 是一种能够将靶蛋白进行纯化分离的实验技术。该试剂盒包含免疫沉淀以及后续 Western blotting 检测所需要的二抗，通过对富集的靶蛋白高效快速分离，以对免疫沉淀实验提供最佳解决方案，同时该试剂盒还具有省时、高效、抗体用量少等优点。
关于试剂盒：
1. IP Lysis Buffer 能够有效提取细胞或组织总蛋白，用于后续IP/Co-IP实验。
2. rProtein A/G Magnetic beads用于沉淀分离抗原抗体复合物。
3. Incubation buffer为抗原抗体结合提供更加温和的孵育环境。
4. 高盐、低 pH 的 Elution buffer 有效用于抗原抗体复合物与rProtein A/G Magnetic beads的解离。
5. HRP-conjugated Mouse Anti-Rabbit IgG Light Chain Specific 二抗用于 Western blotting 的检测，避免了传统二抗带来抗体重链信号的影响。
6. 该试剂盒可广泛用于免疫沉淀以及免疫共沉淀实验。
产品成分
| 组分 | 规格 | 保存 |
| IP lysis buffer | 20 mL/瓶，1 瓶 | 4 ℃，12 个月 |
| Incubation buffer | 15 mL/瓶，1 瓶 | 4 ℃，6 个月 |
| 100 × Protease inhibitor | 2 mL/份，1 份 | -20 ℃，6 个月 |
| 20 × Washing buffer | 10 mL/瓶，1 瓶 | 4 ℃，6 个月 |
| rProtein A/G Magnetic beads | 1 mL/份，1 份 | 4 ℃，12 个月 |
| Elution buffer | 2.5 mL/份，1 份 | 4 ℃，6 个月 |
| Alkali neutralization buffer | 250 uL/份，1 份 | 4 ℃，6 个月 |
| 5× Sample buffer | 800 uL/份，1 份 | -20 ℃，12 个月 |
HRP-conjugated Mouse Anti- Rabbit IgG Light Chain Specific | 200 uL/份，1 份 | 4 ℃，6 个月 |
*客户需要自备：
免疫沉淀所用细胞或组织、免疫沉淀所用抗体，磁力架，1x PBS，垂直旋转混合仪，低温离心机，可调节式移液枪及枪头，去离子水，匀浆器（组织样本）
*本试剂盒单次IP，磁珠使用50 uL，Elution buffer使用80 uL，其他试剂按说明书使用（参考步骤五洗脱），可进行20次IP实验；单次IP磁珠使用30 uL，Elution buffer使用60 uL，其他试剂等比例调整(参考步骤五洗脱)，可进行30次IP实验*试剂盒过期后建议不再使用
使用方法
一、细胞或组织裂解物的制备
a、细胞
1、将离心机预冷至 4 ℃。
2、收集细胞前用血球计数板对细胞进行计数。
3、4 ℃、500 × g 离心 5 min，收集细胞。
4、用冰上预冷的 1 × PBS洗涤细胞三次，每 106个 细胞加入100 uL预冷的 IP lysis buffer（现加 Protease inhibitor 至 1 x ），建议准备IP实验组和对照组各300-500 uL，Input组50-80 uL用作阳性对照。若需获得高浓度蛋白裂解物，可以适量减少 IP lysis buffer 的用量。
*体积可根据具体实验进行调整，每个IP使用体积建议不要低于300 uL。
5、若靶蛋白为磷酸化蛋白质，则需额外加入适量磷酸酶蛋白抑制剂（货号：PR20015）。
6、在IP lysis buffer 中重悬细胞，冰上裂解 30 min，期间每 10 min 轻柔颠倒一次。
7、后续步骤见裂解与保存。
b、组织
1、解剖目的组织，用预冷的 1 × PBS洗涤组织，尽可能去除组织中存留的血液，在冰上将目的组织剪成碎块。
2、将组织碎块置于预冷的匀浆器中。
3、以每毫克目的组织 10-20 uL IP lysis buffer 的量加入相应数量的 IP lysis buffer （现加 Protease inhibitor 至 1x ），建议准备实验组和对照组各300-500 uL，Input组50-80 uL用作阳性对照。
*体积可根据具体实验进行调整，每个IP使用体积建议不要低于300 uL。
4、对目的组织充分匀浆，冰上裂解 30 min，期间每 10 min 颠倒一次。
5、后续步骤见裂解与保存。
c、裂解与保存
1、超声波破碎细胞或组织裂解物，使得裂解更加充分，同时使 DNA 片段化，整个超声过程在冰上进行。不同的样品最适超声功率和时间不同，在180 W 功率下（超声2 s停2 s 的循环），一般细胞超声 1 min，组织超声 2 min。
*功率和时间需要根据裂解物体积适当调整，对于免疫共沉淀实验建议短时超声20-30 s即可。
2、裂解物冰上放置 20-30 min，期间每 10 min 颠倒一次。
3、4 ℃、10,000 × g 离心 10-15 min，将上清转入新的 EP 管中备用；弃沉淀或储存用于后续问题分析。
4、通过 BCA 法测定裂解物的总蛋白浓度，推荐使用商品化BCA蛋白浓度检测试剂盒（货号：PK10026）。
5、裂解物用于 IP 或 Western blotting 实验，也可以分装于-80 ℃ 保存。
6、若用于Western blotting 实验，SDS-PAGE检测前，需向裂解物中加入 25 % 样品体积的5 × Sample buffer，并沸水浴加热 5 min。
二、rProtein A/G Magnetic beads 的准备
在需要加入beads前30 min开始准备即可，轻轻顺时针旋转混匀储存rProtein A/G Magnetic beads的管子，取出所需数量的 rProtein A/G Magnetic beads磁性分离弃去保存液，用 1 x PBS 洗涤 beads 三次（每次1 mL PBS，磁性分离，弃去洗涤液），最后用1 x PBS将 beads 重悬至原体积。
本试剂盒beads建议单个IP使用量50 uL，多次实验可以合并洗涤，实际使用中，可以适当调整磁珠用量，一般不建议低于30 uL。
*每次吸弃上清时，需要等待30 s-2 min保证磁珠完全被吸附，且EP管需置于磁力架上，防止吸取到磁珠。
三、裂解物预处理（可选）
1、吸取重悬的 rProtein A/G Magnetic beads ，加入含有裂解物的 EP 管中。通 常 1-3 mg 总蛋白裂解物需加入 30 uL 重悬的 rProtein A/G Magnetic beads 。
2、4 ℃ 旋转孵育30-60 min（推荐用垂直旋转混合仪，低速旋转）。
3、磁性分离，将上清转入新的 EP 管中。
注意：
*仅在裂解物中含有大量IgG或初次实验出现beads的非特异性结合时需要进行预处理，其他多数时候可以省略。
*本试剂盒所提供的beads数量并不支持每一次IP均预处理，可能需要额外购买用于预处理的beads。
四、免疫沉淀
1、取含有1-3 mg 总蛋白的裂解物（或预处理）300-500 uL，加入新的1.5 mL的EP管中，同时加入80%-100%裂解物体积的Incubation buffer（现加 Protease inhibitor 至 1 x）和1-4 ug 特异性抗体，最佳抗体量由抗体效价决定。
2、向相同数量的裂解物与Incubation buffer（现加 Protease inhibitor 至 1 x）中加入同种属相同数量的 Control IgG 作为阴性对照（作为阴性对照，后续所有操作须与特异性抗体实验组完全一致）。
3、4 ℃ 下，旋转孵育过夜或 2-4 h。
4、向 EP管中加入准备好的重悬的 rProtein A/G Magnetic beads 以沉淀免疫复合物，4 ℃旋转孵育 1-4 h。
5、将EP管放在磁力加上，充分吸附磁珠后，弃除上清。
6、每次用 1 mL 1 × Washing buffer（取适量20 x Washing buffer、用纯水稀释至1 x ，并现加 Protease inhibitor 至 1 x ）洗涤沉淀复合物，重复洗涤 3次。每次洗涤结束后，用磁力架吸附磁珠后，弃除上清，每次尽量弃除干净。
五、洗脱
1、取下含有磁珠的EP管，向留有沉淀复合物的EP管中加入80 uL Elution buffer，充分和磁珠混匀，室温静置 5-10 min，期间可以轻轻摇晃2-3次，重悬沉淀复合物，以达到更好的洗脱效果。用磁力架吸附磁珠后，转移上清至新的写好标记的EP管。
2、向洗脱产物中加入 10 uL Alkali neutralization buffer 以及 23 uL 5 × Sample Buffer ，沸水浴加热 5 min。
* 若希望得到更高浓度的IP目的蛋白产物，可以适当减少Elution buffer，Alkali neutralization buffer和5 × Sample Buffer的使用量，最低Elution buffer使用量不建议低于50 uL。
* 如果Elution buffer用量调整为60 uL，Alkali neutralization buffer和5 × Sample Buffer的使用量等比例减少，本试剂盒共可以完30次的IP实验。
六、Western blotting 分析
1、取 20-40 uL IP 样品加入 SDS-PAGE对应泳道， 同样可以将剩余 IP 样品置于-80 ℃ 保存备用。
2、通过 SDS-PAGE分离 IP 样品，并将蛋白质向 PVDF 膜转移。使用检测抗体杂交以及 1:1000-1:2000 稀释度的 HRP-conjugated Mouse Anti-Rabbit IgG Light Chain Specific 二抗进行 Western blotting 分析。
七、补充信息
1、如果需要缩短 IP 实验操作时间，也可以将靶蛋白对应的特异性抗体以及 rProtein A/G Magnetic beads 同时加入细胞或组织裂解物中进行一步孵育。
2、必要时，该试剂盒可以按比例扩大使用。
注意事项
1. 该试剂盒仅用于细胞或组织裂解物的免疫沉淀和免疫共沉淀实验。
2. 除特别说明外，所有操作在冰上完成。
3. 碱中和液避免接触皮肤以及眼睛。
问题解决
问题 | 可能原因 | 解决方法 |
| 未获得靶蛋白 | 高浓度去垢剂影响抗原抗体结合 | 制备高浓度的细胞或组织裂解物，使用 前用孵育缓冲液稀释 |
| 裂解物中靶蛋白表达丰度低或靶蛋白降解 | 增加使用裂解物总蛋白的数量；通过 Western blotting验证裂解物中靶蛋白表达；更换新鲜的蛋白酶抑制剂 | |
| 抗体没有与靶蛋白抗原结合 | 更换识别不同表位的抗体，增加抗体使用量 | |
| 抗原抗体复合物没有被 rProtein A/G beads 沉淀 | 抗体属于 IgM 亚型，使用抗 IgM 偶联的微粒沉淀抗原抗体复合物 | |
| 洗脱物的抗体信号影响靶蛋白信号 | 靶蛋白大小在 25-35 kDa 左右 | 选择使用 HRP-conjugated protein A 二抗； 使用两个种属不同的抗体分别用于 IP 过程和后续 Western blotting 分析 |
免疫沉淀实验如何选择检测二抗
IP捕获抗体类型 | WB检测时一抗类型 | WB检测时二抗类型 | 备注说明 |
小鼠单抗/多抗 | 小鼠单抗 | HRP-标记 Protein A | WB 检测时一般的 HRP-标记抗小鼠 IgG 二抗可产生严重的重链轻链干扰信号；HRP-标记 Protein A 可以有效降低重链信号强度，消减轻链信号； |
小鼠多抗 | |||
兔抗 | HRP-标记抗兔 IgG二抗 | 由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体，故 WB 检测时使用 HRP-标记抗兔 IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。 | |
兔抗 | 小鼠单抗 | HRP-标记抗小鼠IgG二抗 | 由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体，故 WB 检测时使用 HRP-标记抗小鼠IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。 |
小鼠多抗 | |||
兔抗 | 1、HRP-标记Protein A | 1、WB 检测时 HRP-标记抗兔 IgG 二抗会产生很强的重链轻链信号，以及背景信号，对结果分析有一定影响； |
说明书发布时间和修订时间
发布时间：2025年12月
