WB样本制备的关键——裂解液选择指南

蛋白样品制备是 WB 实验的第一步，也是 WB 成功的关键所在。大家通常认为样品制备很简单，普遍对这一步骤重视度不够，当 WB 失败时往往仅改变操作条件而忽视样品问题。其实 WB 实验内参不齐或检测不到、背景高、蛋白检测困难、无法检出等问题，都有可能是样品制备无效导致的，所以一定要注意样品制备中的细节，以保证蛋白样品的质量！一次完美的WB，蛋白样品的质量决定了WB的结果，而裂解液的选择则直接决定了蛋白样品的质量。面对市面上众多的裂解液，该如何选择呢？

裂解液的组分

常见裂解液由缓冲体系、盐离子、离液剂、蛋白酶抑制剂和还原剂组成，其中离液剂决定了此款裂解液的裂解能力，也是整个裂解液中最核心的部分。

离液剂通常分为两类：

第一类是通过与蛋白质之间形成大量氢键实现助溶作用，如尿素或硫脲类。此类裂解液裂解能力强，提取的蛋白质大多数已经属于变性状态，只推荐用于Western Blot实验。

第二类是表面活性剂也称为去垢剂，其通过疏水性尾部与蛋白质疏水部分结合，亲水性头部暴露在液体环境，来实现助溶作用。此类离液剂相对较为温和，能够保持蛋白质的活性，可用于Western Blot、IP、Co-IP、ELISA等实验。

高浓度的阴离子表面活性剂SDS除外，SDS作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内的分子间的氢键，使蛋白分子去折叠，从而破坏了蛋白质分子的空间结构。

裂解液的种类

裂解液的种类主要是通过离液剂的种类及含量来划分，不同的离液剂的种类及含量也决定此款裂解液的裂解效果，下面我们以Proteintech的裂解液来讲述：

咱们的裂解液共五款，裂解强度如上图所示依次减弱：

（1）裂解强度最强的SDS裂解液：有效成分为10% SDS，通过高浓度的SDS能够破坏蛋白质的空间结构，同时通过与蛋白质之间形成大量氢键实现助溶，裂解时间短，对于裂解困难或容易降解的样品能够起到非常好的效果，但是由于提取的蛋白质空间结构已经被破坏，样品对于后续使用有很大的局限性，只推荐用于Western Blot实验。

（2）RIPA裂解液系列分为强、中、弱三款，此类裂解液相对于SDS裂解液会相对温和，提取的蛋白质维持着天然活性，试用范围更加广泛，Western Blot、IP、Co-IP、ELISA等实验均适合。

（3）Co-IP裂解液是一款非常温和的裂解液，不仅能够保持目标蛋白质的天然活性，还能保持与目标蛋白相关联的蛋白质连接不受影响，同时对于大多数酶切类实验所用酶的活力也无干扰。是一款Co-IP实验和磷酸化抗体检测中λPP酶切实验的完美裂解液。

如何选择裂解液

如何选择我们需要的裂解液，还得从我们实验类型来选择。

（1）Western Blot

WB实验所需的蛋白样品以变性蛋白为主，可以直接根据裂解强度来选择。至于如何做最优选择，让我们先来看一组实验结果：

附图说明：lane1:SDS裂解液；lane2:RIPA裂解液（强）；lane3:RIPA裂解液（中）lane4:RIPA裂解液（弱）。

由上述实验不难看出如下几点：

1）SDS裂解液和RIPA裂解液系列强中弱这四款裂解液对于WB样品均有较好的提取效果；

2）组织的裂解难度高于细胞，制备组织样本时可以选择裂解强度高的裂解液（如上图A、D）；

3）裂解液对于动物组织样本膜蛋白提取效果都不太理想（如上图B）。

并且通过上述实验我们似乎很容易得出一个结论：WB实验选用的裂解液强度越强越好。

但事实却并非如此。

决定裂解液裂解强度的是去垢剂的含量，裂解强度通常和去垢剂含量成正比，但是高浓度的去垢剂往往会带来比较高的背景（如上图），所以裂解液的选用需要结合样本种类和类型选择信噪比最佳的裂解液。如：

1）动物组织样本裂解难度>培养的细胞，选用裂解液时动物组织样本优先选用裂解强度高的SDS裂解液和RIPA裂解液（强）；

2）胞浆蛋白提取难度<亚细胞器蛋白，选用裂解液时胞浆蛋白选用温和的RIPA裂解液（中）和RIPA裂解液（弱）即可。

3）而对于一些亚细胞蛋白多数为疏水性蛋白，提取难度高，需要选用对应专用的亚细胞器提取试剂盒制备。

（2）IP和Co-IP

IP实验的蛋白样品提取既要考虑提取的蛋白质活性，又要考虑到溶解能力，综合考虑首选RIPA裂解液（中）。

当背景高时可以适当的提升裂解强度，选用RIPA裂解液（强）；当目的蛋白信号弱时可以适当的降低裂解强度，可选用RIPA裂解液（弱）或Co-IP裂解液。但SDS裂解液是不推荐用于IP实验的。

至于Co-IP实验我们就直接通过实验来说话吧，见下图：

综合可见，上述4种裂解液单纯用于IP实验效果基本一致，但用于Co-IP实验的效果并不完全一致。

具体为：蛋白互作较强时（如上图A1/A2），4种裂解液之间差异不大；蛋白互作较弱时（如上图B1/B2），4种裂解液之间存在明显差异，Co-IP裂解液效果最佳，RIPA(强)效果最差。

由此可见Co-IP裂解液作为Co-IP实验效果最佳，其次RIPA(弱)，再次RIPA(中)，最次RIPA(强)。

（3）λPP酶处理类实验

λPP酶处理类实验选择裂解液的关键是裂解液的组分不能影响λPP酶的活性，同时兼顾裂解效果，对于这类实验推荐Co-IP裂解液，Proteintech磷酸化抗体检测所用的λPP酶切样品均使用的这款Co-IP裂解液制备！

注意：λPP酶切样品制备时避免使用含有磷酸盐的PBS洗涤样品，磷酸根离子也会影响λPP酶，可以选择不含磷酸盐的TBS或生理盐水洗涤样本。

看到这，有没有一种Proteintech公司的裂解液可以用于制备所有类型的总蛋白的信心，其实并不是这样。

裂解液提取的总蛋白种类更多为提取难度较小的亲水性蛋白，而对于一些结构复杂（如跨膜蛋白）和疏水性蛋白（如一些亚细胞器蛋白）其提取效果有限，此类蛋白需选用专用的亚细胞提取试剂盒进行提取。如下图：

WB样本制备裂解液选择攻略

一图就能帮助你选择到最合适的裂解液