细胞膜蛋白抽提试剂盒

使用方法

1、提取前准备：将试剂盒中试剂室温解冻，后放置于冰上。提前4℃预冷离心机。膜蛋白抽提试剂A和膜蛋白抽提试剂B根据提取的样本量分别取出对应体积的试剂，在使用前按100:1添加蛋白酶抑制剂混合液（100×）备用。

2、样品预处理

a、对于细胞：收集细胞4℃，500 g离心5 min，用预冷的PBS洗涤两遍，尽可能吸取残留的PBS。然后在冰上，按每2000万细胞直接加入1 mL预冷的膜蛋白抽提试剂A。

b、对于组织：现取新鲜的动物组织，用冰的PBS洗净组织块上附着的脂肪和血液等杂质，用滤纸吸干水分后称重，在离心管中将组织块剪碎，然后在冰上，按每100 mg组织加1 mL预冷的膜蛋白抽提试剂A。

3、将样品悬液转移到合适大小的预冷玻璃匀浆器中，在冰浴条件下对样品匀浆30-50次。注：不同的样品所需匀浆次数不同。鉴定方法：取20 uL匀浆30次后的细胞样品或组织样品，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液，混匀，在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性（蓝色）细胞数目的比例，当阳性（蓝色）细胞破碎达到80%即可停止匀浆，请勿过度匀浆。若阳性（蓝色）细胞比例未达到80%，适当增加5-10次匀浆，随后按照同样的方法使用台盼蓝溶液进行鉴定。

注：对于培养的细胞也可以采用涡旋震荡法和反复冻融法来破碎细胞。

涡旋震荡法：将步骤2中已经加入了膜蛋白抽提试剂A的样品，在涡旋仪上剧烈涡旋1 min（涡旋10 s，停10 s），然后冰上放置2 min，重复涡旋及放置步骤4-5次，然后取少量样品台盼蓝染色检测其细胞破碎程度，如果细胞破碎程度不足80%，可以增加剧烈涡旋次数，直到细胞破碎程度大于80%。

反复冻融法：将步骤2中已经加入了膜蛋白抽提试剂A的样品，在液氮和室温依次反复冻融两次，然后取少量样品台盼蓝染色检测其细胞破碎程度，如果细胞破碎程度不足80%，可以增加反复冻融次数，直到细胞破碎程度大于80%。

4、将匀浆好的样品4℃，700 g离心10 min，收集上清（吸取上清时不要接触沉淀）。

5、将收集的上清4℃，16000 g离心30 min，沉淀为细胞膜碎片，上清为细胞胞浆蛋白。

6、向收集的沉淀中加入100 uL膜蛋白抽提试剂B。在涡旋仪上高速剧烈涡旋，涡旋10 s停10 s共2 min，冰浴10 min，重复涡旋及冰浴步骤3次，以充分抽提膜蛋白。

7、4℃，16000 g离心10 min，收集上清即为细胞膜蛋白。

8、根据实验需要，按照3:1比例，混合细胞膜蛋白样品和SDS-PAGE上样缓冲液。100℃沸水浴加热5 min，以充分变性蛋白。冷却至室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

注：用于多次跨膜蛋白检测的膜蛋白样品可以使用37℃水浴45 min代替100℃沸水浴加热5 min，蛋白不易形成聚集体，可以有效保留蛋白的三级结构。如一些ATPase、ABC、SLC、GLUT家族蛋白。