CCK-8试剂盒
Cat No : PF00004
Validation Data Gallery
产品介绍
Cell Counting kit-8 简称 CCK8(或WST-8)试剂盒，是一种基于 WST-8（化学名：2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4- 二磺基苯）-2H- 四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
WST-8工作原理：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在 450 nm 波长处测定 OD 值，间接反映活细胞数量。
WST-8 是 MTT 的一种升级替代产品，和 MTT 或其它 MTT 类似产品如 XTT、MTS 等相比有明显的优点。首先，MTT 被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的 formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而 WST-8 和 XTT、MTS 产生的 formazan 都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8 产生的 formazan 比 XTT 和 MTS 产生的 formazan 相比更易溶解。再次，WST-8 比 XTT 和 MTS 更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8 和 MTT 、XTT 等相比线性范围更宽，灵敏度更高。CCK-8 法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。
| 组分 | 500T | 3000T | 6000T |
| cck-8 | 液体 | ||
保存条件
4℃避光保存1年有效，-20℃避光保存2年有效。
使用方法
1.制作标准曲线（测定细胞具体数量时）
1）先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2）按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个复孔。
3）接种后培养 2-4 h 使细胞贴壁，然后加 CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线，根据此标准线可以测定未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提条件是实验条件一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8 后的培养时间）。
2.细胞活性检测
1）在 96 孔板中接种细胞悬液（100 uL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37 ℃, 5% CO2 ）。
2）向每孔加入 10 uL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡， 它们会影响 OD 值的读数）。
3）将培养板在培养箱内孵育 1-4 h。
4）用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。
5）若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 uL 0.1 M 的HCl溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 h 内测定，吸光度不会发生变化。
3.细胞增殖毒性检测
1）在 96 孔板中配置 100 uL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24 h （37 ℃，5% CO2 ）。
2）向培养板加入 1-10 uL 不同浓度的待测物质。
3）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或 48 h）。
4）向每孔加入 10 uL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。
5）将培养板在培养箱内孵育 1-4 h。
6）用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。
7）若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 uL 0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 h 内测定，吸光度不会发生变化。
注：如果待测物质有氧化性或还原性，可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。若药物影响比较小，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
注意
1.第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。
2.接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。
3.培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基。
4.建议采用多通道移液器，减少平行孔间的误差，加 CCK-8 时，建议斜贴着培养板壁加，若插到培养基液面下加，容易产生气泡， 干扰 OD 值。
5.若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8，含有酚红的培养基不影响测定。
6.CCK-8 对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。
7.可以使用大于 600 nm 的波长，例如 650 nm ，作为参考波长进行双波长测定，CCK-8 在参考波长处没有吸光值，设定参考波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。
8.如果实验中待测物质有氧化还原剂，在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入 CCK-8 试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较（只加 CCK-8 试剂），如果 OD 值明显偏高，则说明有反应。
9.加 CCK-8 试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入 CCK-8 试剂后轻震培养板，为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养基稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。
10.CCK-8 反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。
计算公式：
细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%
抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%
As:实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质）吸光度
Ac:对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质）吸光度
Ab:空白孔（不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8）吸光度
Publications
| Application | Title |
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