CCK-8试剂盒

Cat No : PF00004



产品介绍

Cell Counting kit-8 简称 CCK8(或WST-8)试剂盒,是一种基于 WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4- 二磺基苯)-2H- 四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。


WST-8工作原理:在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。使用酶标仪在 450nm 波长处测定 OD 值,间接反映活细胞数量。

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WST-8 是 MTT 的一种升级替代产品,和 MTT 或其它 MTT 类似产品如 XTT、MTS 等相比有明显的优点。首先,MTT 被线粒体内的一些脱氢 酶还原生成的 formazan 不是水溶性的,需要有特定的溶解液来溶解;而 WST-8 和 XTT、MTS 产生的 formazan 都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤。其次,WST-8 产生的 formazan 比 XTT 和 MTS 产生的 formazan 相比更易溶解。再次,WST-8 比 XTT 和 MTS 更加稳定,使实验结果更加稳定。另外,WST-8 和 MTT 、XTT 等相比线性范围更宽,灵敏度更高。CCK 法应用非常广泛,如药物筛选、细胞增殖测定、 细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

 组分 100T 500T 3000T 6000T
 cck-8 液体


保存条件

4℃避光保存2年有效,-20℃避光保存3年有效。

使用方法

1.制作标准曲线(测定细胞具体数量时) 

1)先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。 

2)按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做 3-5 个细胞浓度梯度,每组 3-6 个复孔。 

3)接种后培养 2-4 h 使细胞贴壁,然后加 CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值,制作出一条以细胞数量为横坐标,OD值为纵坐标的标准曲线,根据此标准线可以测定未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验条件一致,便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8 后的培养时间)。 

2.细胞活性检测 

1)在 96 孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃, 5% CO2 )。 

2)向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液(注意不要在孔中生成气泡, 它们会影响 OD 值的读数)。 

3)将培养板在培养箱内孵育 1-4h。 

4)用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。 

5)若暂时不测定 OD 值,可以向每孔中加入 10 μL 0.1 M 的HCl溶液或者1% w/v SDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 h 内测定,吸光度不会发生变化。 

3.细胞增殖毒性检测 

1)在 96 孔板中配置 100 μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24 h (37℃,5% CO2 )。 

2)向培养板加入 1-10 μL 不同浓度的待测物质。 

3)将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24 或 48 h)。 

4)向每孔加入 10μL CCK-8 溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响 OD 值的读数)。 

5)将培养板在培养箱内孵育 1-4 h。 

6)用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。 

7)若暂时不测定 OD 值,可以向每孔中加入 10 μL 0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 h 内测定,吸光度不会发生变化。 

注:如果待测物质有氧化性或还原性,可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

注意

1.第一次做实验时,建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。 

2.接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不一致。 

3.培养板周围一圈孔培养液容易挥发,为减少误差,建议培养板周围的四边每孔只加培养基。 

4.建议采用多通道移液器,减少平行孔间的误差,加 CCK-8 时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加,容易产生气泡, 干扰 OD 值。 

5.若细胞培养时间较长,培养基颜色或 pH 发生变化,建议更换培养基后再加 CCK-8,含有酚红的培养基不影响测定。 

6.CCK-8 对细胞的毒性非常低,其他的实验,例如中性红法或结晶紫法 ,也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。 

7.可以使用大于 600 nm 的波长,例如 650 nm,作为参考波长进行双波长测定,CCK-8 在参比波长处没有吸光值,设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。 

8.如果实验中待测物质有氧化还原剂,在不含细胞的培养基中加入药物,然后加入 CCK-8 试剂在一定时间内检测,和不加药物的培养基进行比较(只加 CCK-8 试剂),如果 OD 值明显偏高,则说明有反应。 

9.加 CCK-8 试剂时速度要快,减少试剂在移液器上的残留,加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板,为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差,可以在加样前用培养基稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。 

10.CCK-8 反复冻融会增加背景值,干扰实验测定。

计算公式:

细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100% 

抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%  

As:实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质)吸光度 

Ac:对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质)吸光度 

Ab:空白孔(不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8)吸光度

Publications

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