细胞总蛋白提取试剂盒

Cat No : PK10020

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产品介绍

Proteintech细胞总蛋白提取试剂盒适用于提取培养细胞中的总蛋白。此款试剂盒提供的细胞裂解液,能够高效地提取细胞总蛋白,主要包括细胞质、细胞膜、细胞核、核基质、线粒体、内质网、高尔基体等蛋白,得到的细胞总蛋白样品可用于蛋白免疫印迹、免疫沉淀、ELISA检测、蛋白质分析和小规模蛋白层析纯化等其他应用。

关于试剂盒

●本试剂盒提供的细胞裂解液适用于常规的细胞样品提取,易降解类细胞(如:巨噬细胞类RAW 264.7、淋巴细胞类U-937、单核细胞类THP-1等)推荐使用易降解蛋白提取试剂盒(货号:PK10024)。

●细胞裂解液是一款非变性裂解Buffer,提取的蛋白适用于蛋白免疫印迹、免疫沉淀、ELISE检测、蛋白质分析等。

●细胞裂解液在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物,用于磷酸化样本的制备推荐使用专用的磷酸化蛋白提取试剂盒(货号:PK10023)。

●样品制备完成后及时使用或分装保存在-80℃。

●如果每个样品的数量为1000万个细胞,本试剂盒可以处理30个样品。

●试剂盒各组分需在室温完全解冻后再使用,试剂盒过期后建议不要使用。


组分规格保存条件
细胞裂解液30 mL-20℃保存一年

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(4X)

10 mL-20℃保存一年
普通型蛋白酶抑制剂混合物(100X)0.5 mL-20℃保存一年

0.4%台盼蓝溶液

1 mL-20℃保存一年


保存条件

-20℃保存,一年有效。一个月内使用可4℃保存。


使用方法

1. 细胞处理

a. 瓶内裂解法(效果最佳):适用于所有的贴壁细胞

 (1)吸净培养基,用冰的PBS清洗细胞表面2遍(动作轻柔,防止细胞脱落),尽可能吸取残留的PBS。

 (2)在冰上按每1000万细胞加入1 mL预冷的细胞裂解液(细胞裂解液在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物)于细胞瓶、培养板或培养皿中,用移液管吹散贴壁的细胞,对于贴壁紧的细胞也可使用细胞刮收集,收集裂解液,在冰上放置30 min,期间每10 min上下颠倒混匀一次。

b. 离心法:适用于悬浮细胞和药物处理过的细胞

 (1)使用细胞刮收集细胞悬液(连同培养基一起收集),4℃,500 g离心5 min,收集沉淀,沉淀用预冷的PBS洗涤两遍,收集细胞沉淀,尽可能吸取残留的PBS。

 (2)按每1000万细胞加入1 mL预冷的细胞裂解液,在冰上放置30 min,期间每10 min上下颠倒混匀一次。

注意:

(1)细胞的收集优先使用瓶内裂解法处理,瓶内裂解法可以有效的防止细胞在离心过程中破碎,能有效地提高总蛋白得率,同时也能保留细胞外基质(ECM)。

(2)对于药物处理过的贴壁细胞则推荐使用离心法收集,因为药物处理过的细胞往往贴壁不牢,在PBS清洗阶段容易丢失。

(3)不推荐使用胰酶消化,胰酶消化细胞不仅会造成细胞外基质(ECM)的完全丢失,同时会剪切一些对胰酶敏感的蛋白。

(4)一些细胞粘度高(HEK-293)和密度高的悬浮细胞(Jurkat、K562等)在加入细胞裂解液后容易形成絮状物,此时应及时的使用超声破碎仪将其打散。


2. 超声处理

    将裂解的蛋白样品放在冰上超声破碎,200 W,2 min(开2 s,关2 s),充分打断核酸序列。


3. 样品的使用与保存

 (1)用于免疫沉淀、ELISA等非变性蛋白分析实验,4℃,10000 g离心5 min分离上清,取部分样品用来测浓度,剩下的蛋白样品可直接分成数管保存在-20℃或-80℃。

 (2)用于免疫印迹的变性蛋白分析实验,取部分样品用来测浓度,剩下的蛋白样品按照3:1比例,混合蛋白样品和SDS-PAGE上样缓冲液。100℃沸水浴加热5 min,以充分变性蛋白。冷却至室温后,4℃,10000 g离心5 min分离上清,可直接上样到SDS-PAGE胶加样孔或分成数管保存在-20℃或-80℃。

注意:

    用于免疫印迹的变性蛋白分析,在加入SDS-PAGE上样缓冲液煮样后再离心,可提高总蛋白的得率。


注意

1. 提取细胞总蛋白样品的所有步骤都需在低温下进行。

2. SDS-PAGE蛋白上样缓冲液中含少量DTT,有轻微刺激性气味,但不含剧毒的巯基乙醇。为取得最佳的使用效果,尽量避免过多的反复冻融,可以适当分装使用。

3. 提取得到的细胞总蛋白可以使用Proteintech的BCA蛋白浓度检测试剂盒(货号:PK10026)测定蛋白浓度,不适用Bradford法测蛋白浓度,。

4. 本试剂盒中试剂都应在室温下溶解,请勿加热。

5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴好一次性手套操作。


问题解答

问题可能原因
解决方案
裂解不充分
裂解液加入量过少加充足的裂解液
样品浓度低裂解液加入量过多

减少加入的裂解液

样品粘度大核酸未被打断成小片段对样品进行超声波处理
有白色沉淀细胞粘度高而结团

发现结团时迅速使用超声波将其打散