CoraLite®594 TUNEL凋亡检测试剂盒（红色荧光）

使用方法

实验材料（自备） 

1、PBS缓冲液 (pH～7.4);     

2、4% 多聚甲醛 (in  PBS);     

3、牛血清白蛋白（BSA) 或正常的羊、牛血清;     

4、70%乙醇 (自选);     

5、脱蜡溶剂 (石蜡切片样本); 

实验步骤

一、样本准备： 

1.细胞样品 

1）可选：准备一份阴性对照样本（加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液）。 

2）PBS 清洗细胞两次。 

3）细胞固定：加入适量 4% 多聚甲醛（pH 7.4）溶液，4℃放置 30 min。 

4）PBS 清洗细胞两次。 

5）通透细胞：加入冰上预冷的 70% 乙醇，在 -20℃孵育 4 h。细胞能在 70% 乙醇中 -20℃的条件下保存一周。或者细胞可用含 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液通透，室温放置 20 min。 

6）PBS 清洗细胞两次。 

2.石蜡组织切片 

1）室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次，每次 5 min，以彻底脱掉石蜡。 

注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。 

2）室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次，每次 5 min。 

3）室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗 1 次，每次 5 min。 

4）室温下，将切片依次浸没于纯水、1× PBS中各漂洗 1 次，每次 3 min，用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。 

5）用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。 

6）按 1:50 的比例，将 2 mg/ml 的 Proteinase K 溶液用 1× PBS稀释，使其终浓度为 40 ug/mL。每个样本上滴加100 uL稀释好的 Proteinase K 溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min。（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同 类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要优化孵育时间长短。时间一般为 10-30 min，4 um 左右的片子可以用 10 min，30 um 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

7）PBS 浸润清洗切片 2 次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。 

注：这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

3.冰冻组织切片 

1）将冰冻切片放置于室温的片架上，室温 20 min，晾干。 

2）将载玻片浸没在 4% 多聚甲醛溶液（in PBS）中，室温固定 30 min。 

3）PBS 浸润清洗切片 2 次，每次 5 min。 

4）用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。 

5）按 1:50 的比例，将 2 mg/ml 的 Proteinase K 溶液用 1× PBS稀释，使其终浓度为 40 ug/mL。每个样本上滴加100 uL稀释好的 Proteinase K 溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min。（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同 类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要优化孵育时间长短。时间一般为 10-30 min，4 um 左右的片子可以用 10 min，30 um 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

6）PBS 浸润清洗切片 2 次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

注：这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

4.阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行 TUNEL 反应步骤) 

1）按 1:10 的比例用 ddH2O 将 10 × DNase I Buffer 稀释成 1 × DNase I Buffer 备用。 

2）滴加 100 uL 1 × DNase I Buffer 到已通透的样本上，室温平衡 5 min。 

3）用 1 × DNase I Buffer 以 1:100 稀释 DNase I (2 U/uL)， 使其为终浓度 20 U/mL 的工作液。 

4）轻轻吸掉多余液体，加入 100 uL 浓度为 20 U/mL DNase I 工作液，室温孵育 10 min。 

5）轻轻吸掉多余液体，PBS 清洗样品 2 次。 

二、TUNEL 反应 

1.预先配制 TUNEL 反应液（即用即配）：每个样本需要已加入 2 uL TdT 酶的 50 uL TUNEL 反应液（例如2 uL TdT 酶加入到48 uL TUNEL 反应缓冲液中，多个样本以此类推)。 

2.用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体，每个样本加入 50 uL TUNEL 反应混合液。 

1）贴壁细胞，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃ 避光孵育 60 min。 

2）悬浮细胞，可加入微孔板中，采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管，使之充分反应。37℃避光孵育 60 min。 

3）组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内，湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育2 h。 

3.去掉反应液，在 1 × PBS 的染色缸中浸泡润洗 2 次，每次 5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100，其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3 次，每次 5 min，以降低背景。 

4.（可选）复染：每个样本滴加浓度为 2 ug/mL 的 DAPI 染液，避光室温孵育 10 min。染色完后，轻轻去掉染液，并将样本在 1 × PBS 中浸泡润洗 3 次，每次 5 min。 

5.（可选）封片：将切片样本先纯水浸没 5 min，再依次放入 70% 乙醇、80% 乙醇、90% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇各浸没 5 min，最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理 2 次，每次 5 min。（通风厨中操作）。脱水完成后，擦去切片周围的液体，每个切片样本滴加 50 uL 抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。 

6.用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析，CL594是一种红色荧光染料，激发波长、发射波长分别为 593 nm, 614 nm（凋亡细胞应被标记上明亮的红色荧光，没有加入 TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光）。