易降解蛋白提取试剂盒

Product Information

消化系统（胃肠道等）、生殖系统（睾丸、卵巢等）、腺状体（胰腺、胸腺等）、肺、肝脏、斑马鱼及一些易降解的细胞（如：巨噬细胞类RAW 264.7、淋巴细胞类U-937、单核细胞类THP-1）等样品，含有丰富的蛋白酶，在制样过程中会被释放到裂解液中，将靶标蛋白内源性剪切而碎片化，形成片段更小的杂带，从而增加了我们蛋白提取的难度。Proteintech研发的这款易降解蛋白提取试剂盒通过改进裂解液组分，能够有效的防止样品在制备过程中的降解，同时此款试剂盒提供了非变性和变性两款裂解液，客户可根据下游检测选择合适的裂解液。得到的蛋白样品可用于蛋白免疫印迹、免疫沉淀、ELISA等蛋白分析实验。

关于试剂盒

●本试剂盒提供了两款裂解Buffer，易降解蛋白裂解BufferA是一款变性裂解Buffer，提取的样品仅推荐使用SDS-PAGE，免疫印迹等实验，而裂解BufferB是一款基于非变性去垢剂来制备与多数下游检测兼容的裂解物，包括蛋白免疫印迹、免疫沉淀、ELISA检测，蛋白质分析等。

●用于SDS-PAGE，免疫印迹等变性蛋白的研究，推荐使用易降解蛋白裂解BufferA，其具有更强的裂解能力，能有效阻止蛋白酶对蛋白的降解，保护目标蛋白完整性。

●易降解蛋白裂解BufferA在低温下会析出，可使用30℃水浴复溶。

●易降解蛋白裂解BufferA和B在使用前加倍添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物（即1 mL加入20-30 uL），用于磷酸化样本的制备推荐使用专用的磷酸化蛋白提取试剂盒（货号：PK10023）。

●此试剂盒适用于消化系统（胃肠道等）、生殖系统（睾丸、卵巢等）、腺状体（胰腺、胸腺等）、肺、肝脏、斑马鱼及一些易降解的细胞（如：巨噬细胞类RAW 264.7、淋巴细胞类U-937、单核细胞类THP-1等）等样品。

●样品制备完成后及时使用或分装保存在-80℃。

●如果每个样品的数量为1000万个细胞或100 mg组织，本试剂盒可以处理30个样品。

●试剂盒各组分需在室温完全解冻后再使用，试剂盒过期后建议不要使用。

产品介绍

保存条件

-20℃保存，一年有效。一个月内使用可4℃保存。

使用方法

1. 易降解类细胞（如：巨噬细胞类RAW 264.7、淋巴细胞类U-937、单核细胞类THP-1等）：使用离心法收集细胞

1.1 使用细胞刮收集细胞悬液（连同培养基一起收集），4℃，500 g离心5 min，收集沉淀，沉淀用预冷的PBS（使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物）洗涤两遍，收集细胞沉淀，尽可能吸取残留的PBS。

1.2 按每1000万细胞加入1 mL易降解蛋白裂解BufferA或B（蛋白裂解Buffer在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物）。

注意：

（1）加入易降解蛋白裂解BufferA后，样品粘度会很高，无需在冰水放置30 min，可以直接冰浴进行超声破碎。

（2）使用易降解蛋白裂解BufferA的操作，温度过低会析出，推荐在4℃冰箱或加冰块的泡沫箱中操作即可。如果出现温度过低样品析出的情况，可将样品放在室温直至重新复溶。

（3）用于IP、CO-IP、ELISA检测等实验选用易降解蛋白裂解BufferB制备样品，不要选用易降解蛋白裂解BufferA制备。

2. 易降解组织样本：消化系统（胃肠道等）、生殖系统（睾丸、卵巢等）、腺状体（胰腺、胸腺等）、肺、肝脏等。

2.1 组织的采集与保存

（1）采集组织样本前先对动物去除血液（血液去除越干净越好），接着迅速解剖，采集所需要的组织样本，浸泡在添加了增强型蛋白酶抑制剂混合物冰的PBS中。

（2）消化系统（胃肠道等）、生殖系统（睾丸、卵巢等）、腺状体（胰腺、胸腺等）、肺、肝脏、斑马鱼及一些易降解的细胞（巨噬细胞和淋巴细胞类）等样品现取现制备，不推荐冻存。 

2.2 组织样清洗

（1）对于血液含量丰富的易降解组织样本如：肝脏、肺等组织，剪碎使用添加了增强型抑制剂混合物冰的PBS洗涤液清洗2-3遍（可以适当按压排出血液），直至样本血红色变浅，滤纸吸干水分称重。

（2）对于脂肪含量丰富的易降解组织样本，预先把样本放在几层纸巾上按压，去除部分脂类，然后再使用添加了增强型抑制剂混合物冰的PBS清洗1-2遍，滤纸吸干水分称重.

（3）对于胃肠道等易降解组织样本：剥离干净胃肠道表面的脂肪，然后使用注射器吸取含有增强型抑制剂混合物的PBS对胃肠道里面进行冲洗数次（请勿直接剪开刮洗，容易丢失胃肠道表面肠黏膜等相关蛋白），直至流出的PBS干净无异物，滤纸吸干水分称重。

2.3 组织样破碎及裂解

a. 液氮研磨法：将剪碎的组织块在研钵中加入液氮，快速研磨至细粉状，转移至EP管中，按每100 mg组织加1 mL预冷的易降解蛋白裂解BufferA或B（蛋白裂解Buffer在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物），使用移液器上下吹打混匀，直至完全溶解。

 b. 冷冻研磨机法：提前开启冷冻研磨机预冷，将吸干水分的组织样本剪成1-2 mm左右的小块，按照每管100 mg分装到2 mL离心管，同时每管加入1粒5 mm的研磨珠。将离心管和适配器放入液氮里浸泡速冻。将离心管和适配器转移到冷冻研磨机，使用65HZ研磨45 s，如果研磨效果不理想可中断15 s后重复研磨一次。每管加1 mL预冷的组织样品裂解BufferA或B（蛋白裂解Buffer在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物），使用移液器上下吹打混匀，直至完全溶解。

注意：

（1）优先推荐选用液氮研磨法和冷冻研磨机法，其破碎效果最佳；不推荐使用匀浆法，匀浆法易产生热量，加快降解。

（2）使用冷冻研磨机法对液氮速冻过的样本进行破碎，对离心管的材质要求比较高，需选用专用的离心管。

（3）用于SDS-PAGE，免疫印迹等变性蛋白的研究，推荐使用易降解蛋白裂解BufferA，其具有更强的裂解能力和阻止蛋白酶对蛋白的降解，能有效的保护目标蛋白完整性。

（4）加入易降解蛋白裂解BufferA后，样品粘度会很高，无需在冰水放置30 min，可以直接冰浴进行超声破碎。

（5）使用易降解蛋白裂解BufferA的操作，温度过低会析出，推荐在4℃冰箱或加冰块的泡沫箱中操作即可。如果出现温度过低样品析出的情况，可将样品放在室温直至重新复容。

（6）用于IP、CO-IP、ELISA检测等实验选用易降解蛋白裂解BufferB制备样品，不要选用易降解蛋白裂解BufferA制备。

3. 斑马鱼等冷血动物类：推荐匀浆法

（1）取适量易降解蛋白裂解BufferA或B（蛋白裂解Buffer在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物），在70℃水浴锅中预热。

（2）将清洗干净的斑马鱼吸干水分，按每100 mg组织加1 mL预热的组织样品裂解BufferA或B，在70℃水浴锅中匀浆30-50次。期间可取适量样品使用台盼蓝染色鉴定破碎程度，直至完全破碎。

鉴定方法：取20 uL匀浆30次后的样品，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液，混匀，在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性（蓝色）细胞数目的比例，当阳性（蓝色）细胞完全破碎，即可停止匀浆。若阳性（蓝色）细胞破碎不完全，则可适当增加5-10次匀浆，随后按照同样的方法使用台盼蓝溶液进行鉴定。 

4. 超声处理：将裂解的蛋白样品放在冰上超声破碎，200 W，2 min（开2 s,关2 s），冰上放置2 min后再重复200 W超声2 min一次，充分打断核酸序列。 

5. 样品的使用与保存

5.1  用于免疫沉淀、ELISA等非变性蛋白分析实验，4℃，10000 g离心5 min分离上清，取部分样品用来测浓度，剩下的蛋白样品可直接分成数管保存在-20℃或-80℃。

5.2  用于免疫印迹的变性蛋白分析实验，取部分样品用来测浓度，剩下的蛋白样品按照3：1比例，混合蛋白样品和SDS-PAGE上样缓冲液。100℃沸水浴加热5 min，以充分变性蛋白。冷却至室温后，4℃，10000 g离心5 min分离上清，可直接上样到SDS-PAGE胶加样孔或分成数管保存在-20℃或-80℃。

注意：

    用于免疫印迹的变性蛋白分析，在加入SDS-PAGE上样缓冲液煮样后再离心，可提高总蛋白的得率。

注意

1. 提取的易降解蛋白样品的所有步骤都需在低温下进行。

2. SDS-PAGE蛋白上样缓冲液中含少量DTT，有轻微刺激性气味，但不含剧毒的巯基乙醇。为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融，可以适当分装使用。

3. 提取得到的总蛋白可以使用Proteintech的BCA蛋白浓度检测试剂盒（货号：PK10026）测定蛋白浓度，不适用Bradford法测蛋白浓度。

4. 本试剂盒中试剂都应在室温下溶解，请勿加热。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴好一次性手套操作。

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