免疫沉淀试剂盒（HRP标记蛋白A）

使用方法

一、细胞或组织裂解物的制备

a、细胞

1、将离心机预冷至 4 °C。 

2、收集细胞前用血球计数板对细胞进行计数。 

3、4 °C、500 × g 离心 5 min，收集细胞。 

4、用冰上预冷的 1 × PBS 洗涤细胞三次，每 10⁶个 细胞加入 100 uL 预冷的 IP lysis buffer（现加 Protease inhibitor 至 1 x ）。若需获得高浓度蛋白裂解物，可以适量减少 IP lysis buffer 的用量。 

5、若靶蛋白为磷酸化蛋白质，则需额外加入适量磷酸酶蛋白抑制剂（货号：PR20015）。 

6、在 IP lysis buffer 中重悬细胞，冰上裂解 30 min，期间每 10 min 轻柔颠倒一次。 

7、后续步骤见裂解与保存。

b、组织

1、解剖目的组织，用预冷的 1 × PBS 洗涤组织，尽可能去除组织中存留的血液，在冰上将目的组织剪成碎块。 

2、将组织碎块置于预冷的匀浆器中。 

3、以每毫克目的组织 10-20 uL IP lysis buffer 的量加入相应数量的 IP lysis buffer （现加 Protease inhibitor 至 1x ）。 

4、对目的组织充分匀浆，冰上裂解 30 min，期间每 10 min 颠倒一次。 

5、后续步骤见裂解与保存。

c、裂解与保存 

1、超声波破碎细胞或组织裂解物，使得裂解更加充分，同时使 DNA 片段化。不同样品最适超声时间不同，在 180 W 功率下（超声2 s停2 s 的循环），一般细胞超声 1 min，组织超声 2-5 min，整个超声过程在冰上进 行。 

2、裂解物冰上放置 20-30 min，期间每 10 min 颠倒一次。 

3、4 °C、10,000 × g 离心 10-15 min，将上清转入新的 EP 管中备用；弃沉淀或 储存用于后续问题分析。 

4、通过 BCA 法测定裂解物的总蛋白浓度，推荐使用商品化BCA蛋白浓度检测试剂盒（货号：PK10026）。 

5、裂解物用于 IP 或 Western blotting 实验，也可以分装于-80 °C 保存。

6、若用于 Western blotting 实验，SDS-PAGE 检测前，需向裂解物中加入 25 % 样品体积的 5 × Sample buffer ，并 沸水浴加热 5 min。 

二、 rProtein A/G beads 的准备 

      上下颠倒混匀储存 rProtein A/G beads slurry 的管子，取出所需数量的 rProtein A/G beads slurry，用 1 x PBS 低速离心洗涤 beads 三次（每次可1 ml PBS，500 g 离心30 s），最后用 PBS 将 beads 重悬至原体积。

      本试剂盒beads建议单个IP使用量20-50 ul，初次实验可按30 ul取用，可根据实验结果，适当增加或者减少beads的用量。

三、 裂解物预处理（可选） 

1、以 45°角剪掉已灭菌枪头的末端，快速吸取重悬的 rProtein A/G beads slurry，加入含有裂解物的 EP 管中。通常 1-3 mg 总蛋白裂解物需加入 30 uL 重悬的 rProtein A/G beads slurry。 

2、 4 °C 旋转孵育 30-60 min（推荐用垂直旋转混合仪，低速旋转）。 

3、 4 °C、500 g 离心 1 min，将上清转入新的 EP 管中。 

四、免疫沉淀 

1、吸取含有 1-3 mg 总蛋白的裂解物（或预处理）200-350 uL，加入下端带有 End caps 的 Spin columns 中，同时加 入 1-4 ug 特异性抗体以及 150-300 uL Incubation buffer，最佳抗体数量应由抗体效价决定。 

2、向相同数量的裂解物与 Incubation buffer 中加入同种属相同数量的 Control IgG 作为阴性对照（阴性对照管的 后续操作与目的样本管完全一样）。 

3、4 °C 下，旋转孵育过夜或 2-4 h。 

4、向 Spin columns 中加入准备好的重悬的 rProtein A/G beads slurry 以沉淀免疫复合物，4 ℃旋转孵育 1-4 h。 

5、取下 End caps保留备用，将上清自然流出弃除，必要时，可以通过重悬 rProtein A/G beads 以提高上清的流速。 

6、每次用 800 uL 1 × Washing buffer（取适量20 x Washing buffer、用纯水稀释至1 x ，并现加 Protease inhibitor 至 1 x ）洗涤沉淀复合 物，洗涤液自然流出弃除；重复洗涤 4-5 次。洗涤结束后，在 4 °C，500 g 下将 Spin columns 置入 Collection tubes 中离心 30 s，弃 Collection tubes 以及离心产物。

五、洗脱 

1、用 End caps堵住Spin columns下端出液口，向Spin columns中加入80 uL Elution buffer，盖上盖子，室温静置 5-10 min，期间可以轻轻摇晃2-3次，重悬沉淀复合物，以达到更好的洗脱效果。洗脱完成，取下End caps，将Spin columns 置入新的 1.5 mL EP 管，4 ℃ 10000 g 下离心 1 min 收集产物。

2、向洗脱产物中加入 10 uL Alkali neutralization buffer 以及 23 uL 5 × Sample Buffer ，沸水浴加热 5 min。

3、若希望得到更高浓度的IP目的蛋白产物，可以适当按比例减少Elution buffer，Alkali neutralization buffer和5 × Sample Buffer的使用量，最低Elution buffer使用量不低于40 uL。

六、Western blotting 分析

1、取 20-40 uL IP 样品加入 SDS-PAGE 对应泳道， 同样可以将剩余 IP 样品置 于-80 °C 保存备用。 

2、通过 SDS-PAGE 分离 IP 样品，并将蛋白质向 PVDF 膜 转移。使用检测抗体杂交以及 1:1500-1:3000 稀释度的 HRP-conjugated protein A 二抗进行 Western blotting 分析。

七、补充信息 

1、 如果需要缩短 IP 实验操作时间，也可以将靶蛋白对应的特异性抗体以及 rProtein A/G beads slurry 同时加入细胞或组织裂解物中进行一步孵育。 

2、若 IP 抗体与 WB 一抗同为 mouse IgG1 或 IgG3 亚型, WB 检测时可降低 HRP-conjugated protein A 二抗的稀释度， 若显影目的信号仍然较弱，可考虑使用 Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)二抗。 

3、若 WB 检测时一抗为 mouse IgM 亚型，则不能使用 HRP-conjugated protein A 二抗。 

4、必要时，该试剂盒可以按比例扩大使用。