免疫沉淀试剂盒(HRP标记蛋白A)

Cat No : PK10007



产品介绍

利用抗原抗体亲和结合的特性,免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP) 是一种能够将靶蛋白进行纯化分离的实验技术。该试剂盒包含免疫沉淀以及后续 Western blotting 检测全部试剂,通过对富集的靶蛋白高效快速分离,以对免疫沉淀实验提供最佳解决方案,同时该试剂盒还具有省时、高效、抗体用量少等优点。


关于试剂盒 

 IP lysis buffer 能够有效提取细胞或组织总蛋白,用于后续实验使用。 

 rProtein A/G beads slurry 用于沉淀分离抗原抗体复合物。 

 高盐、低 pH 的 Elution buffer 有效用于抗原抗体复合物与 rProtein A/G beads 的解离。 

 Spin columns 的使用使操作更为方便快捷,且减少靶蛋白的损失,同时降低了非特异性蛋白的影响。 

 HRP-conjugated Protein A 二抗用于 Western blotting 的检测,可以有效消除抗体轻链信号的影响,同时降低抗体重链信号。 

 该试剂盒可广泛用于免疫沉淀以及免疫共沉淀实验。


组分

20次

保存

IP lysis buffer : 30 ml/瓶 1 瓶室温 6 个月
Incubation buffer : 20 ml/瓶1 瓶室温 6 个月
100 × Protease inhibitor : 2 ml / 份1 份-20 ℃ 6 个月
20 × Washing buffer : 20 ml /瓶1 瓶室温 6 个月
rProtein A/G beads slurry : 1 ml/份1 份4 ℃ 6 个月
Elution buffer : 2.5 ml/份1 份4 ℃ 6 个月
Alkali neutralization buffer : 250 μl/份1 份4 ℃ 6 个月
5 × Sample buffer : 800 μl/份1 份室温 6 个月
HRP-conjugated Protein A : 200 μl/份1 份4 ℃ 6 个月
Spin columns : 1 ml20 个室温 12 个月
Collection tubes : 2 ml20 个室温 12 个月
End caps20 个室温 12 个月

*试剂盒过期后建议不再使用

使用方法

一、细胞或组织裂解物的制备

a、细胞

1、将离心机预冷至 4 °C。 

2、收集细胞前用血球计数板对细胞进行计数。 

3、4 °C、500 × g 离心 5 min,收集细胞。 

4、用冰上预冷的 1 × PBS 洗涤细胞三次,每 106个 细胞加入 100 μl 预冷的 IP lysis buffer(现加 Protease inhibitor 至 1 x )。若需获得高浓度蛋白裂解物,可以适量减少 IP lysis buffer 的用量。 

5、若靶蛋白为磷酸化蛋白质,则需额外加入适量磷酸酶蛋白抑制剂(货号:PR20015)。 

6、在 IP lysis buffer 中重悬细胞,冰上裂解 30 min,期间每 10 min 轻柔颠倒一次。 

7、后续步骤见裂解与保存。


b、组织

1、解剖目的组织,用预冷的 1 × PBS 洗涤组织,尽可能去除组织中存留的血液,在冰上将目的组织剪成碎块。 

2、将组织碎块置于预冷的匀浆器中。 

3、以每毫克目的组织 10-20 μl IP lysis buffer 的量加入相应数量的 IP lysis buffer (现加 Protease inhibitor 至 1x )。 

4、对目的组织充分匀浆,冰上裂解 30 min,期间每 10 min 颠倒一次。 

5、后续步骤见裂解与保存。


c、裂解与保存 

1、超声波破碎细胞或组织裂解物,使得裂解更加充分,同时使 DNA 片段化。不同样品最适超声时间不同,在 180 W 功率下(超声2 s停2 s 的循环),一般细胞超声 1 min,组织超声 2-5 min,整个超声过程在冰上进 行。 

2、裂解物冰上放置 20-30 min,期间每 10 min 颠倒一次。 

3、4 °C、10,000 × g 离心 10-15 min,将上清转入新的 EP 管中备用;弃沉淀或 储存用于后续问题分析。 

4、通过 BCA 法测定裂解物的总蛋白浓度。 

5、裂解物用于 IP 或 Western blotting 实验,也可以分装于-80 °C 保存。

6、若用于 Western blotting 实验,SDS-PAGE 检测前,需向裂解物中加入 25 % 样品体积的 5 × Sample buffer ,并 沸水浴加热 5 min。 



二、 rProtein A/G beads 的准备 

上下颠倒混匀储存 rProtein A/G beads slurry 的管子,取出所需数量的 rProtein A/G beads slurry,用 1 x PBS 低速离心洗涤 beads 三次(每次可1 ml PBS,500 g 离心30 s),最后用 PBS 将 beads 重悬至原体积。



三、 裂解物预处理(可选) 

1、以 45°角剪掉已灭菌枪头的末端,快速吸取重悬的 rProtein A/G beads slurry,加入含有裂解物的 EP 管中。通常 1-3 mg 总蛋白裂解物需加入 30 μl 重悬的 rProtein A/G beads slurry。 

2、 4 °C 旋转孵育 30-60 min(推荐用垂直旋转混合仪,低速旋转)。 

3、 4 °C、500 g 离心 1 min,将上清转入新的 EP 管中。 



四、免疫沉淀 

1、吸取含有 1-3 mg 总蛋白的裂解物(或预处理)200-350 μl,加入下端带有 End caps 的 Spin columns 中,同时加 入 1-4 μg 特异性抗体以及 150-300 μl Incubation buffer,最佳抗体数量应由抗体效价决定。 

2、向相同数量的裂解物与 Incubation buffer 中加入同种属相同数量的 Control IgG 作为阴性对照(阴性对照管的 后续操作与目的样本管完全一样)。 

3、4 °C 下,旋转孵育过夜或 2-4 h。 

4、向 Spin columns 中加入 50 μl 重悬的 rProtein A/G beads slurry 以沉淀免疫复合物,4 ℃旋转孵育 1-4 h。 

5、取下 End caps,将上清自然流出弃除,必要时,可以通过重悬 rProtein A/G beads 以提高上清的 流速。 

6、每次用 800 μl 1 × Washing buffer(取适量20 x Washing buffer、用纯水稀释至1 x ,并现加 Protease inhibitor 至 1 x )洗涤沉淀复合 物,洗涤液自然流出弃除;重复洗涤 4-5 次。洗涤结束后,在 4 °C,500 g 下将 Spin columns 置入 Collection tubes 中离心 30 s,弃 Collection tubes 以及离心产物。

 


五、洗脱 

1、将 Spin columns 置入新的 1.5 ml EP 管中以收集洗脱产物,用 40 μl Elution buffer 洗脱沉淀复合物,室温静置 5-10 min,然后 4 ℃ 10000 g 下离心 1 min 收集产物,取新的 40 μl Elution buffer 重复洗脱一次(2 次洗脱合并收集)。 

2、向全部洗脱产物中加入 10 μl Alkali neutralization buffer 以及 23 μl 5 × Sample Buffer ,沸水浴加热 5 min。 



六、Western blotting 分析

1、取 20-40 μl IP 样品加入 SDS-PAGE 对应泳道, 同样可以将剩余 IP 样品置 于-80 °C 保存备用。 

2、通过 SDS-PAGE 分离 IP 样品,并将蛋白质向 PVDF 膜 转移。使用检测抗体杂交以及 1:1500-1:3000 稀释度的 HRP-conjugated protein A 二抗进行 Western blotting 分析。



七、补充信息 

1、 如果需要缩短 IP 实验操作时间,也可以将靶蛋白对应的特异性抗体以及 rProtein A/G beads slurry 同时加入细胞或组织裂解物中进行一步孵育。 

2、若 IP 抗体与 WB 一抗同为 mouse IgG1 或 IgG3 亚型, WB 检测时可降低 HRP-conjugated protein A 二抗的稀释度, 若显影目的信号仍然较弱,可考虑使用 Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)二抗。 

3、若 WB 检测时一抗为 mouse IgM 亚型,则不能使用 HRP-conjugated protein A 二抗。 

4、必要时,该试剂盒可以按比例扩大使用。


注意

· 该试剂盒仅用于细胞或组织裂解物的免疫沉淀和免疫共沉淀实验

 

· 除特别说明外,所有操作在冰上完成。

 

· 碱中和液避免接触皮肤以及眼睛。

问题解答

问题

 可能原因

解决 方法

未获得靶蛋白高浓度去垢剂影响抗原抗体结合制备高浓度的细胞或组织裂解物,使用前用孵育缓冲液稀释
裂解物中靶蛋白表达丰度低或靶蛋白降解增加使用裂解物总蛋白的数量;通过 Western blotting 验证裂解物中靶蛋白表 达;更换新鲜的蛋白酶抑制剂
抗体没有与靶蛋白抗原结合更换识别不同表位的抗体,增加抗体使用量
抗原抗体复合物没有被 rProtein A/G beads 沉淀抗体属于 IgM 亚型,使用抗 IgM 偶联的微 粒沉淀抗原抗体复合物
洗脱物的抗体信号 影响靶蛋白信号靶蛋白大小在 45-55 kDa 左右选择使用 HRP-conjugated Mouse Anti- Rabbit IgG Light Chain Specific 二抗(捕获及检测抗体都为兔抗时);使用两个 种属不同的抗体分别用于 IP 过程和后 续Western blotting 分析

免疫沉淀实验如何选择检测二抗

IP捕获抗体类型

WB检测时一抗类型

WB检测时二抗类型

备注说明

小鼠单抗/多抗

小鼠单抗

HRP-标记Protein A
或HRP-标记抗小鼠IgG二抗

WB 检测时一般的 HRP-标记抗小鼠 IgG 二抗可产生严重的重链轻链干扰信号;HRP-标记 Protein A 可以有效降低重链信号强度,消减轻链信号;
WB 一抗若为 mouse IgG1/IgG3 亚型,HRP-标记 Protein A 亲和力较低,可适当降低其稀释度(也可先尝试HRP-标记抗小鼠IgG二抗);WB 一抗若为小鼠 IgM/IgA  亚型,则避免选择 HRP-标记 ProteinA,因其不结合。

小鼠多抗

兔抗

HRP-标记抗兔IgG二抗

由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体,故 WB 检测时使用 HRP-标记抗兔 IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。

兔抗

小鼠单抗

HRP-标记抗小鼠IgG二抗

由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体,故 WB 检测时使用 HRP-标记抗小鼠IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。

小鼠多抗

兔抗

1、HRP-标记Protein A
2、HRP-标记抗兔IgG轻链特异性抗体

1、WB 检测时 HRP-标记抗兔IgG 二抗会产生很强的重链轻链信号,以及背景信号,对结果分析有一定影响;
2、HRP-标记 Protein A 可以有效降低重链信号以及消减轻链信号的影响,背景干净,适用于检测目的蛋白大小除45-55 kDa 之外的所有目的蛋白,而目的蛋白大小在45-55 kDa 之间时,推荐使用 HRP-标记抗兔 IgG 轻链特异性二抗。

Publications

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