免疫沉淀试剂盒(HRP-抗兔 IgG 轻链)

Cat No : PK10008



产品介绍

利用抗原抗体亲和结合的特性,免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)是一种能够将靶蛋白进行纯化分离的实验技术。该试剂盒 包含免疫沉淀以及后续 Western blotting 检测全部试剂,通过对富集的靶蛋白高效快速分离,以对免疫沉淀实验提供最佳解决方案,同时该试剂盒还具有省时、高效、抗体用量少等优点。 


关于试剂盒 

1. IP lysis buffer 能够有效提取细胞或组织总蛋白,用于后续实验使用。 

2.  rProtein A/G beads slurry 用于沉淀分离抗原抗体复合物。 

3. 高盐、低 pH 的 Elution buffer 有效用于抗原抗体复合物与 rProtein A/G beads 的解离。 

4. Spin columns 的使用使操作更为方便快捷,且减少靶蛋白的损失,同时降低了非特异性蛋白的影响。 

5. HRP-conjugated Mouse Anti-Rabbit IgG Light Chain Specific 二抗用于 Western blotting 的检测,避免了传统二抗带来抗体重 链信号的影响。 

6. 该试剂盒可广泛用于免疫沉淀以及免疫共沉淀实验。



组分

20次

保存

IP lysis buffer : 30 ml/瓶 1 瓶 室温 6 个月
Incubation buffer : 20 ml/瓶 1 瓶 室温 6 个月
100 × Protease inhibitor : 2 ml / 份 1 份 -20 ℃ 6 个月
20 × Washing buffer : 20 ml /瓶 1 瓶 室温 6 个月
rProtein A/G beads slurry :1 ml/份 1 份 4 ℃ 6 个月
Elution buffer : 2.5 ml/份 1 份 4 ℃ 6 个月
Alkali neutralization buffer: 250 μl/份 1 份 4 ℃ 6 个月
5 × Sample buffer : 800 μl/份
1 份 室温 6 个月

HRP-conjugated Mouse Anti-Rabbit 

IgG Light Chain Specific : 200 μl/份

1 份 4 ℃ 6 个月
Spin columns : 1 ml 20 个 室温 12 个月
Collection tube: 2 ml 20 个 室温 12 个月
End caps 20 个 室温 12 个月

*试剂盒过期后建议不再使用


使用方法

1. 细胞或组织裂解物的制备


 细胞

• 将离心机预冷至 4 °C。 

• 收集细胞前用血球计数板对细胞进行计数。 

• 4 °C、500 × g 离心 5 min,收集细胞。 

• 用冰上预冷的 1 × PBS 洗涤细胞三次,每 106个 细胞加入 100 μl 预冷的 IP lysis buffer(现加Protease inhibitor至1 x)。若需获得高浓度蛋白裂解物,可以适量减少 IP lysis buffer 的使用。 

• 若靶蛋白为磷酸化蛋白质,则需额外加入适量磷酸酶蛋白抑制剂(货号:PR20015)。 

• 在 IP lysis buffer 中重悬细胞,冰上裂解 30 min,期间每 10 min 轻柔颠倒一次。 

• 后续步骤见裂解与保存

 

组织

• 解剖目的组织,用预冷的 1 × PBS 洗涤组织,尽可能去除组织中存留的血液,在 冰上将目的组织剪成碎块。 

• 将组织碎块置于预冷的匀浆器中。 

• 以每毫克目的组织 10-20 μl IP lysis buffer 的量加入相应数量的 IP lysis buffer(现加Protease inhibitor至1 x)。 

• 对目的组织充分匀浆,冰上裂解 30 min,期间每 10 min 颠倒一次。 

• 后续步骤见裂解与保存。 


裂解与保存

• 超声波破碎细胞或组织裂解物,使得裂解更加充分,同时使 DNA 片段化。不同样品最适超声时间不同,在 180 W 功率下(超声2 s停2 s 的循环),一般细胞超声 1 min,组织超声 2-5 min,整个超声过程在冰上进行。 

• 裂解物冰上放置 20-30 min,期间每 10 min 颠倒一次。 

• 4 °C、10,000 × g 离心 10-15 min,将上清转入新的 EP 管中备用;弃沉淀或 储存用于后续问题分析。 

• 通过 BCA 法测定裂解物的总蛋白浓度。 

• 裂解物用于 IP 或 Western blotting 实验,也可以分装于-80 °C 保存。 

• 若用于 Western blotting 实验,SDS-PAGE 检测前,需向裂解物中加入 25% 样品体积的 5 × Sample buffer,并沸水浴加热 5 min。 

 


2. rProtein A/G beads 的准备 

 

• 上下颠倒混匀储存 rProtein A/G beads slurry 的管子,取出所需数量的 rProtein A/G beads slurry,用 1 x PBS 低速离心洗涤 beads 三次(每次可1 ml PBS,500 g 离心30 s),最后用 PBS 将 beads 重悬至原体积。

 


3. 裂解物预处理(可选) 

 

• 以 45°角剪掉已灭菌枪头的末端,快速吸取重悬的 rProtein A/G beads slurry,加入含有裂解物的 EP 管中。通常 1-3 mg 总蛋白裂解物需加入 30 μl 重悬的 rProtein A/G beads slurry。 

• 4 °C 旋转孵育 30-60 min(推荐用垂直旋转混合仪,低速旋转)。 

• 4 °C、500 g 离心 1 min,将上清转入新的 EP 管中。 

 


4. 免疫沉淀 

 

• 吸取含有 1-3 mg 总蛋白的裂解物(或预处理)200-350 μl,加入下端带有 End caps 的 Spin columns 中,同时加 入 1-4 ug 特异性抗体以及 150-300 μl Incubation buffer,最佳抗体数量应由抗体效价决定。 

• 向相同数量的裂解物与 Incubation buffer 中加入同种属相同数量的 Control IgG 作为阴性对照(阴性对照管的 后续操作与目的样本管完全一样)。 

• 4 °C 下,旋转孵育过夜或 2-4 h。 

• 向 Spin columns 中加入 50 μl 重悬的 rProtein A/G beads slurry 以沉淀免疫复合物,4 °C 旋转孵育 1-4 h。 

• 取下 End caps,将上清自然流出弃除,必要时,可以通过重悬 rProtein A/G beads 以提高上清的 流速。 

• 每次用 800 μl 1 × Washing buffer(取适量 20 x Washing buffer、用纯水稀释至1 x ,并现加 Protease inhibitor 至1 x)洗涤沉淀复合物,洗涤液自然流出弃除;重复洗涤 4-5 次。洗涤结束后,在 4 °C,500 g 下将 Spin columns 置入 Collection tubes 中离心 30 s,弃 Collection tubes 以及离心产物。 

 


5. 洗脱 

 

• 将 Spin columns 置入新的 1.5 ml EP 管中以收集洗脱产物,用 40 μl Elution buffer 洗脱沉淀复合物,室温静置 5-10 min,然后 4 ℃ 10000 g 下离心 1 min 收集产物,取新的 40 μl Elution buffer 重复洗脱一次(2 次洗脱合并收集)。 

• 向全部洗脱产物中加入 10 μl Alkali neutralization buffer 以及 23 μl 5 × Sample Buffer ,沸水浴加热 5 min。

 


6. Western blotting 分析 

 

• 取 20-40 μl IP 样品加入 SDS-PAGE 对应泳道, 同样可以将剩余 IP 样品置 于-80 °C 保存备用。 

• 通过 SDS-PAGE 分离 IP 样品,并将蛋白质向 PVDF 膜 转移。使用检测抗体杂交以及 1:1000-1:2000 稀释度的 HRP-conjugated Mouse Anti-Rabbit IgG Light Chain Specific 二抗进行 Western blotting 分析。 

 


补充信息 

 

• 如果需要缩短 IP 实验操作时间,也可以将靶蛋白对应的特异性抗体以及 rProtein A/G beads slurry 同时加 入细胞或组织裂解物中进行一步孵育。 

• 必要时,该试剂盒可以按比例扩大使用

 



注意

该试剂盒仅用于细胞或组织裂解物的免疫沉淀和免疫共沉淀实验。 

除特别说明外,所有操作在冰上完成。 

碱中和液避免接触皮肤以及眼睛。

问题解决


问题

可能原因

解决 方法

未获得靶蛋白 高浓度去垢剂影响抗原抗体结合
制备高浓度的细胞或组织裂解物,使用 前用孵育缓冲液稀释
裂解物中靶蛋白表达丰度低或靶蛋白降解 增加使用裂解物总蛋白的数量;通过 Western blotting验证裂解物中靶蛋白表达;更换新鲜的蛋白酶抑制剂
抗体没有与靶蛋白抗原结合 更换识别不同表位的抗体,增加抗体使 用量
抗原抗体复合物没有被 rProtein A/G beads 沉淀 抗体属于 IgM 亚型,使用抗 IgM 偶联的 微粒沉淀抗原抗体复合物
洗脱物的抗体信号 影响靶蛋白信号 靶蛋白大小在 25-35 kDa 左右 选择使用 HRP-conjugated protein A 二抗; 使用两个种属不同的抗体分别用于 IP 过 程和后续 Western blotting 分析


免疫沉淀实验如何选择检测二抗

IP捕获抗体类型

WB检测时一抗类型

WB检测时二抗类型

备注说明

小鼠单抗/多抗

小鼠单抗

HRP-标记 Protein A
或 HRP-标记抗小鼠 IgG 二抗

WB 检测时一般的 HRP-标记抗小鼠 IgG 二抗可产生严重的重链轻链干扰信号;HRP-标记 Protein A 可以有效降低重链信号强度,消减轻链信号;
WB一抗若为 mouse IgG1/IgG3 亚型,HRP-标记 Protein A 亲和力较低,可适当降低其稀释度(也可先尝试 HRP-标记抗小鼠 IgG 二抗);WB 一抗若为小鼠 IgM/IgA 亚型,则避免选择 HRP-标记 Protein A,因其不结合。

小鼠多抗

兔抗

HRP-标记抗兔 IgG二抗

由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体,故 WB 检测时使用 HRP-标记抗兔 IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。

兔抗

小鼠单抗

HRP-标记抗小鼠IgG二抗

由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体,故 WB 检测时使用 HRP-标记抗小鼠IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。

小鼠多抗

兔抗

1、HRP-标记Protein A
2、HRP-标记抗兔IgG 轻链特异性抗体

1、WB 检测时 HRP-标记抗兔 IgG 二抗会产生很强的重链轻链信号,以及背景信号,对结果分析有一定影响;
2、HRP-标记 Protein A可以有效降低重链信号以及消减轻链信号的影响,背景干净,适用于检测目的蛋白大小除 45-55 kDa 之外的所有目的蛋白,而目的蛋白大小在 45-55 kDa 之间时,推荐使用 HRP-标记抗兔 IgG 轻链特异性二抗。



Publications

ApplicationTitle

J Hazard Mater

Dual effects of JNK activation in blood-milk barrier damage induced by zinc oxide nanoparticles.

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Sci Total Environ

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IP

J Cancer

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