免疫沉淀试剂盒(HRP-抗兔 IgG 轻链)
Cat no : PK10008
Validation Data Gallery
Product Information
利用抗原抗体亲和结合的特性,免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)是一种能够将靶蛋白进行纯化分离的实验技术。该试剂盒 包含免疫沉淀以及后续 Western blotting 检测全部试剂,通过对富集的靶蛋白高效快速分离,以对免疫沉淀实验提供最佳解决方案,同时该试剂盒还具有省时、高效、抗体用量少等优点。
关于试剂盒
1. IP lysis buffer 能够有效提取细胞或组织总蛋白,用于后续实验使用。
2. rProtein A/G beads slurry 用于沉淀分离抗原抗体复合物。
3. 高盐、低 pH 的 Elution buffer 有效用于抗原抗体复合物与 rProtein A/G beads 的解离。
4. Spin columns 的使用使操作更为方便快捷,且减少靶蛋白的损失,同时降低了非特异性蛋白的影响。
5. HRP-conjugated Mouse Anti-Rabbit IgG Light Chain Specific 二抗用于 Western blotting 的检测,避免了传统二抗带来抗体重 链信号的影响。
6. 该试剂盒可广泛用于免疫沉淀以及免疫共沉淀实验。
产品介绍
组分 | 20次 | 保存 |
IP lysis buffer : 30 mL/瓶 | 1 瓶 | 4 ℃ 12 个月 |
Incubation buffer : 20 mL/瓶 | 1 瓶 | 4 ℃ 6 个月 |
100 × Protease inhibitor : 2 mL/份 | 1 份 | -20 ℃ 6 个月 |
20 × Washing buffer : 20 mL/瓶 | 1 瓶 | 4 ℃ 6 个月 |
rProtein A/G beads slurry :800 uL/份 | 1 份 | 4 ℃ 12 个月 |
Elution buffer : 2.5 mL/份 | 1 份 | 4 ℃ 6 个月 |
Alkali neutralization buffer: 250 uL/份 | 1 份 | 4 ℃ 6 个月 |
5 × Sample buffer : 800 uL/份 | 1 份 | -20 ℃ 12 个月 |
HRP-conjugated Mouse Anti-Rabbit IgG Light Chain Specific : 200 uL/份 | 1 份 | 4 ℃ 6 个月 |
Spin columns : 1 mL | 20 个 | 室温 12 个月 |
Collection tubes : 2 mL | 20 个 | 室温 12 个月 |
End caps | 20 个 | 室温 12 个月 |
*试剂盒过期后建议不再使用
使用方法
1. 细胞或组织裂解物的制备
细胞
• 将离心机预冷至 4 °C。
• 收集细胞前用血球计数板对细胞进行计数。
• 4 °C、500 × g 离心 5 min,收集细胞。
• 用冰上预冷的 1 × PBS 洗涤细胞三次,每 106个 细胞加入 100 uL 预冷的 IP lysis buffer(现加Protease inhibitor至1 x)。若需获得高浓度蛋白裂解物,可以适量减少 IP lysis buffer 的使用。
• 若靶蛋白为磷酸化蛋白质,则需额外加入适量磷酸酶蛋白抑制剂(货号:PR20015)。
• 在 IP lysis buffer 中重悬细胞,冰上裂解 30 min,期间每 10 min 轻柔颠倒一次。
• 后续步骤见裂解与保存。
组织
• 解剖目的组织,用预冷的 1 × PBS 洗涤组织,尽可能去除组织中存留的血液,在 冰上将目的组织剪成碎块。
• 将组织碎块置于预冷的匀浆器中。
• 以每毫克目的组织 10-20 uL IP lysis buffer 的量加入相应数量的 IP lysis buffer(现加Protease inhibitor至1 x)。
• 对目的组织充分匀浆,冰上裂解 30 min,期间每 10 min 颠倒一次。
• 后续步骤见裂解与保存。
裂解与保存
• 超声波破碎细胞或组织裂解物,使得裂解更加充分,同时使 DNA 片段化。不同样品最适超声时间不同,在 180 W 功率下(超声2 s停2 s 的循环),一般细胞超声 1 min,组织超声 2-5 min,整个超声过程在冰上进行。
• 裂解物冰上放置 20-30 min,期间每 10 min 颠倒一次。
• 4 °C、10,000 × g 离心 10-15 min,将上清转入新的 EP 管中备用;弃沉淀或 储存用于后续问题分析。
• 通过 BCA 法测定裂解物的总蛋白浓度,推荐使用商品化BCA蛋白浓度检测试剂盒(货号:PK10026)。
• 裂解物用于 IP 或 Western blotting 实验,也可以分装于-80 °C 保存。
• 若用于 Western blotting 实验,SDS-PAGE 检测前,需向裂解物中加入 25% 样品体积的 5 × Sample buffer,并沸水浴加热 5 min。
2. rProtein A/G beads 的准备
• 上下颠倒混匀储存 rProtein A/G beads slurry 的管子,取出所需数量的 rProtein A/G beads slurry,用 1 x PBS 低速离心洗涤 beads 三次(每次可1 ml PBS,500 g 离心30 s),最后用 PBS 将 beads 重悬至原体积。
• 本试剂盒beads建议单个IP使用量20-50 ul,初次实验可按30 ul取用,可根据实验结果,适当增加或者减少beads的用量。
3. 裂解物预处理(可选)
• 以 45°角剪掉已灭菌枪头的末端,快速吸取重悬的 rProtein A/G beads slurry,加入含有裂解物的 EP 管中。通常 1-3 mg 总蛋白裂解物需加入 30 uL 重悬的 rProtein A/G beads slurry。
• 4 °C 旋转孵育 30-60 min(推荐用垂直旋转混合仪,低速旋转)。
• 4 °C、500 g 离心 1 min,将上清转入新的 EP 管中。
4. 免疫沉淀
• 吸取含有 1-3 mg 总蛋白的裂解物(或预处理)200-350 uL,加入下端带有 End caps 的 Spin columns 中,同时加 入 1-4 ug 特异性抗体以及 150-300 uL Incubation buffer,最佳抗体数量应由抗体效价决定。
• 向相同数量的裂解物与 Incubation buffer 中加入同种属相同数量的 Control IgG 作为阴性对照(阴性对照管的 后续操作与目的样本管完全一样)。
• 4 °C 下,旋转孵育过夜或 2-4 h。
• 向 Spin columns 中加入准备好的重悬的 rProtein A/G beads slurry 以沉淀免疫复合物,4 °C 旋转孵育 1-4 h。
• 取下 End caps保留备用,将上清自然流出弃除,必要时,可以通过重悬 rProtein A/G beads 以提高上清的流速。
• 每次用 800 uL 1 × Washing buffer(取适量 20 x Washing buffer、用纯水稀释至1 x ,并现加 Protease inhibitor 至1 x)洗涤沉淀复合物,洗涤液自然流出弃除;重复洗涤 4-5 次。洗涤结束后,在 4 °C,500 g 下将 Spin columns 置入 Collection tubes 中离心 30 s,弃 Collection tubes 以及离心产物。
5. 洗脱
• 用 End caps堵住Spin columns下端出液口,向Spin columns中加入80 uL Elution buffer,盖上盖子,室温静置 5-10 min,期间可以轻轻摇晃2-3次,重悬沉淀复合物,以达到更好的洗脱效果。洗脱完成,取下End caps,将Spin columns 置入新的 1.5 mL EP 管,4 ℃ 10000 g 下离心 1 min 收集产物。
• 向洗脱产物中加入 10 uL Alkali neutralization buffer 以及 23 uL 5 × Sample Buffer,沸水浴加热 5 min。
• 若希望得到更高浓度的IP目的蛋白产物,可以适当按比例减少Elution buffer,Alkali neutralization buffer和5 × Sample Buffer的使用量,最低Elution buffer使用量不低于40 uL。
6. Western blotting 分析
• 取 20-40 uL IP 样品加入 SDS-PAGE 对应泳道, 同样可以将剩余 IP 样品置 于-80 °C 保存备用。
• 通过 SDS-PAGE 分离 IP 样品,并将蛋白质向 PVDF 膜转移。使用检测抗体杂交以及 1:1000-1:2000 稀释度的 HRP-conjugated Mouse Anti-Rabbit IgG Light Chain Specific 二抗进行 Western blotting 分析。
补充信息
• 如果需要缩短 IP 实验操作时间,也可以将靶蛋白对应的特异性抗体以及 rProtein A/G beads slurry 同时加 入细胞或组织裂解物中进行一步孵育。
• 必要时,该试剂盒可以按比例扩大使用
注意
该试剂盒仅用于细胞或组织裂解物的免疫沉淀和免疫共沉淀实验。
除特别说明外,所有操作在冰上完成。
碱中和液避免接触皮肤以及眼睛。
问题解决
问题 |
可能原因 |
解决 方法 |
未获得靶蛋白 |
高浓度去垢剂影响抗原抗体结合 |
制备高浓度的细胞或组织裂解物,使用 前用孵育缓冲液稀释 |
裂解物中靶蛋白表达丰度低或靶蛋白降解 | 增加使用裂解物总蛋白的数量;通过 Western blotting验证裂解物中靶蛋白表达;更换新鲜的蛋白酶抑制剂 | |
抗体没有与靶蛋白抗原结合 | 更换识别不同表位的抗体,增加抗体使 用量 | |
抗原抗体复合物没有被 rProtein A/G beads 沉淀 | 抗体属于 IgM 亚型,使用抗 IgM 偶联的 微粒沉淀抗原抗体复合物 | |
洗脱物的抗体信号 影响靶蛋白信号 | 靶蛋白大小在 25-35 kDa 左右 |
选择使用 HRP-conjugated protein A 二抗; 使用两个种属不同的抗体分别用于 IP 过 程和后续 Western blotting 分析 |
免疫沉淀实验如何选择检测二抗
IP捕获抗体类型 |
WB检测时一抗类型 |
WB检测时二抗类型 |
备注说明 |
小鼠单抗/多抗 |
小鼠单抗 |
HRP-标记 Protein A |
WB 检测时一般的 HRP-标记抗小鼠 IgG 二抗可产生严重的重链轻链干扰信号;HRP-标记 Protein A 可以有效降低重链信号强度,消减轻链信号; |
小鼠多抗 |
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兔抗 |
HRP-标记抗兔 IgG二抗 |
由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体,故 WB 检测时使用 HRP-标记抗兔 IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。 |
|
兔抗 |
小鼠单抗 |
HRP-标记抗小鼠IgG二抗 |
由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体,故 WB 检测时使用 HRP-标记抗小鼠IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。 |
小鼠多抗 |
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兔抗 |
1、HRP-标记Protein A |
1、WB 检测时 HRP-标记抗兔 IgG 二抗会产生很强的重链轻链信号,以及背景信号,对结果分析有一定影响; |
Publications
Application | Title |
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J Hazard Mater Dual effects of JNK activation in blood-milk barrier damage induced by zinc oxide nanoparticles. | |
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