Validation Data Gallery
产品介绍
Protein G是链球菌表面的一种细胞壁蛋白，可以结合哺乳动物免疫球蛋白部份亚型的Fc区，本产品是偶联有重组Protein G的beads，具有高结合力，高载量的特点，可应用于免疫沉淀/免疫共沉淀实验以及抗体的纯化。具体性能如下表:
| 指标 | 性能 |
| 基质 | 磁性琼脂糖微球 |
| 配体 | 重组蛋白G |
| 载量 | >30 mg 人lgG/mL微球（固体体积） |
| 粒径（um） | 20-99 |
| pH稳定范围 | 3-10 |
| 储存缓冲液 | 含20%乙醇的1×PBS |
| 储存温度 | 2℃-8℃ |
保存条件
Beads保存在含20%乙醇的PBS中， 2℃-8℃保存，有效期2年。不可低于0℃保存。
使用方法
使用本产品前，先确认一抗种属和亚型，参考下表确认本产品与之兼容。如不确定亚型或出于兼容考虑，可以考虑Protein A/G Magarose beads，其结合能力参考下表。
种属 | 亚型 | Protein A 结合力 | Protein G 结合力 |
Human | IgA | varible | — |
IgD | — | — | |
IgE | — | — | |
IgG1 | ++++ | ++++ | |
IgG2 | ++++ | ++++ | |
IgG3 | — | ++++ | |
IgG4 | ++++ | ++++ | |
IgM | varible | — | |
Avian egg yolk | IgY | — | — |
Cow | ++ | ++++ | |
Dog | ++ | + | |
Goat | — | ++ | |
Guinea pig | IgG1 | ++++ | ++ |
IgG2 | ++++ | ++ | |
Hamster | + | ++ | |
Horse | ++ | ++++ | |
Koala | — | + | |
Llama | — | + | |
Monkey (rhesus) | ++++ | ++++ | |
Mouse | IgG1 | + | ++++ |
IgG2a | ++++ | ++++ | |
IgG2b | +++ | +++ | |
IgG3 | ++ | +++ | |
IgM | variable | — | |
Pig | +++ | +++ | |
Rabbit | no distinction | ++++ | +++ |
Rat | IgG1 | — | + |
IgG2a | — | ++++ | |
IgG2b | — | ++ | |
IgG3 | + | ++ | |
Sheep | +/- | ++ |
++++=结合能力强；++=结合能力中等；—=结合能力弱或没有结合。
免疫沉淀
方式一（SDS Sample buffer洗脱法）
1. 用预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer裂解细胞或组织。取1-3 mg总蛋白的裂解物（体积控制在300-500 uL），加入80%-100%裂解物体积的Incubation buffer，加入1-4 ug特异性抗体，4℃旋转过夜。
2. 吸取等量蛋白裂解物，加入等量Incubation buffer并加入同种属等量的IgG孵育作为Control IgG对照组。4℃旋转过夜。
3. 将 Protein G Magarose Beads 轻柔颠倒数次，保证磁珠完全混匀，按每个IP取30-50 uL磁珠悬浮液，计算需要使用的磁珠总体积，移液器取计算体积的磁珠悬浮液转移至离心管中，将离心管放置在磁分离器上，静置30 s-1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液。再将离心管磁从分离器上取下来，加入1 mL的PBS，使用枪头轻轻反复吹打 5 次，将离心管置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液，总共洗涤3次，用PBS重悬至取用磁珠的原体积。
4. 加入30-50 uL重悬的 Protein G Magarose beads，4℃ 旋转孵育1-4 h。
5. 用1 × Washing buffer（现加蛋白酶抑制剂）洗涤沉淀复合物，磁性分离，弃上清，累计洗涤3次。 最后一次洗涤上清尽量去除干净。
6. 加入100 uL 1 × Sample Buffer，重悬IP复合物beads，沸水浴加热5 min。
*为了获得更高的IP产物浓度，1x Sample Buffer可以适当减少，一般不建议低于50 uL。
7. 磁性分离吸附磁珠后，小心吸取上清转入新的EP管中。
8. 取20-40 uL样品进行免疫印迹检测，设置Control IgG对照和Input对照。
方式二（酸洗脱法）
1. 用预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer裂解细胞或组织。取1-3 mg总蛋白的裂解物300-500 uL于1.5 mL微量离心管中，加入80%-100%裂解物体积的Incubation buffer，加入1-4 ug特异性抗体，4℃旋转过夜。
2. 吸取等量蛋白裂解物，加入等量Incubation buffer并加入同种属等量的IgG孵育作为Control IgG对照组。4℃旋转过夜。
3. 将 Protein G Magarose Beads 轻柔颠倒数次，保证磁珠完全混匀，按每个IP取30-50 uL磁珠悬浮液，计算需要使用的磁珠总体积，移液器取计算体积的磁珠悬浮液转移至离心管中，将离心管放置在磁分离器上，静置30 s-1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液。再将离心管磁从分离器上取下来，加入1 mL的PBS，使用枪头轻轻反复吹打 5 次，将离心管置于磁分离器上，大约 1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液，总共洗涤3次，用PBS重悬至取用磁珠的原体积。
4. 向纯化柱中加入30-50 uL重悬的Protein G Magarose beads，4℃旋转孵育1-4 h。
5. 将离心管放置在磁分离器上，静置30 s-1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液。
6. 用1 × Washing buffer（现加蛋白酶抑制剂）洗涤沉淀复合物，磁性分离，弃上清，累计洗涤3次。 最后一次洗涤上清尽量去除干净。
7. 向离心管中加入80 uL Elution buffer，使用枪头轻轻反复吹打 5 次，室温静置5-10 min，期间可以轻轻摇晃2-3次，重悬沉淀复合物，以达到更好的洗脱效果，将离心管放置在磁分离器上，静置30 s-1 min，待溶液变澄清后，用移液器将洗脱产物转移至新的做好标记的离心管中。
8. 向有洗脱产物的离心管中加入10 uL 碱中和液以及23 uL 5 x Sample Buffer，沸水浴加热5 min。
*为了获得更高的IP产物浓度，Elution buffer，碱中和液和5 x Sample Buffer可以按比例减少， 一般不建议Elution buffer低于50 uL。
9. 取20-40 uL样品进行免疫印迹检测，设置Control IgG对照和Input对照。
参考配方：
RIPA裂解液 | 配制：1000 mL |
Tris | 6 g |
NaCl | 8.76 g |
脱氧胆酸钠 | 5 g |
SDS | 1 g |
NaF | 0.42 g |
EDTA.2Na.2H₂O | 1.86 g |
Triton X-100 | 10 mL |
盐酸调pH至7.4，补ddH₂O定容至1000 mL，4°C保存 | |
注：PMSF及其它蛋白酶抑制剂现用现加 | |
5X SDS sample buffer | 配制；50 mL |
Tris HCl (1M母液，pH 7.0) | 12.5 mL |
甘油 | 17.5 mL |
SDS | 7.5 g |
溴酚蓝 | 15 mg |
补ddH2O至37.5 mL，分装并保存在-20°C | |
现用现加还原剂：25% DTT (2M母液) | |
Incubation buffer | 配制：1000 mL |
KCl | 0.2 g |
KH2PO4 | 0.2 g |
Na2HPO4·12H2O | 1.14 g |
NaCl | 8 g |
NaF | 0.42 g |
EDTA.2Na.2H2O | 1.86 g |
1 M NaOH调pH至7.4，补ddH₂O定容至1000 mL，4°C保存 | |
Washing buffer (1 x TBST） | 配制：1000 mL |
Tris | 2.42 g |
NaCl | 8.76 g |
KCl | 0.373 g |
Tween-20 | 2 mL |
盐酸调pH至7.4，补ddH₂O定容至1000 mL | |
洗脱液 (Elution buffer) | 配制：500 mL |
NaCl | 14.6 g |
Glycine | 5.625 g |
调pH至1.5-2.0，补ddH₂O定容至500 mL，4°C保存 | |
碱中和液 (Alkali neutralization buffer) | |
NaOH溶液 | 0.9 M~1.3 M |
The final concentration is adjusted addcording to Elution buffer | |
