CoraLite®488-Annexin V 和 PI 细胞凋亡检测试剂盒

Cat No : PF00005



产品介绍

CoraLite®488-Annexin V 和 PI 细胞凋亡检测试剂盒提供了一种快速简便的方法,通过标记早期凋亡细胞(绿色)和晚期凋亡细胞或坏死细胞(红色),用于检测细胞凋亡水平。产品可以使用流式细胞仪或其它荧光检测设备进行检测。 


Annexin V 可以选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,简称PS)。在细胞发生早期凋亡时,PS 会外翻到细胞表面,即细胞膜外侧。 用绿色荧光探针 CL488 标记的 Annexin V,即 CL488-Annexin V,可以结合外翻的磷酯酰丝氨酸,从而检测凋亡早期的细胞。CL488 染料与荧光素/FITC 相比,荧光亮度更高,且不受环境中 pH 的影响,具有良好的光稳定性。 


碘化丙啶(Propidium lodide, PI)是一种 DNA 结合染料,它可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞的细胞核。PI 可以由 488, 532 或 546nm 的激光激发,呈现红色荧光。

PF00005-1.jpg

       Annexin V/PI 检测细胞凋亡原理图

 组分50T100T
 1×Annexin V结合缓冲液50 mL50 mL X 2
 CL488-Annexin V250 μL500 μL
 PI500 μL1 mL


保存条件

4℃避光冷藏,请勿冻存。本产品在推荐条件下至少可以储存24个月。

使用方法

下列实验方案以利用星形孢菌素诱导 Jurkat 细胞凋亡为例,如果使用其他诱导剂和其他类型的细胞,实验条件需要略作调整。

一、流式细胞检测 

1.根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品,作为阴性对照。此外,设定一组样品做单染,用于调节补偿。

2.收集细胞。悬浮细胞:300 g,4 ℃ 离心 5 min 收集细胞; 贴壁细胞:用不含EDTA 的胰酶消化后300 g,4 ℃离心收集细胞,胰酶消化时间不宜过长,以防引起假阳性。

注:用胰蛋白酶消化后,将细胞在最佳细胞培养条件和培养基中恢复约 30 min,然后再染色。胰蛋白酶消化会暂时破坏质膜,允许 Annexin V 结合磷脂酰丝氨酸在细胞膜的细胞质表面上,从而导致假阳性染色。

3.用预冷的PBS洗涤细胞两次,每次均在300 g,4 ℃下离心5 min,收集1-5×105个细胞并用 100 μL 1×结合缓冲液重悬细胞。  

4.每管加入 4-5 μL 的 CL488-Annexin V 和 5 μL 的 PI 工作液。

注:我们推荐准备两管额外的流式管,每管中只加入一种单染染料(CL488-Annexin V 和 PI),用于流式单染的补偿调节。

5.室温避光孵育 10-15 min,为避免细胞凋亡进程,孵育过程可在冰上操作。 

6.每管加入 400 μL 的 PBS 或 1 X 结合缓冲液,尽快通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。CL488-Annexin V 由 488 nm 激光激发,检测荧光发射光谱在 530 nm 处(FITC 通道),PI 通道发射光谱约在 617 nm 处。

注:PBS 或 1X 结合缓冲液的选择根据不同凋亡处理以及不同细胞具体选择。

二、荧光显微镜检测

对于悬浮细胞,可参照流式细胞检测的方法进行具体操作。 

1.在盖玻片或载玻片小室中接种细胞。 

2.根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品,作为阴性对照。 

3.用 PBS 洗涤细胞。 

注:细胞收集后如果不用 PBS 清洗,可以用含血清的培养基直接替代 Annexin V 结合缓冲液,但是 Annexin V 的使用浓度需要重新优化。 

4.每 100 μL 的 1 X Annexin V 结合缓冲液中加入 5-25 μL 的 CL488-Annexin V 和 5 μL 的 PI。

注:最佳使用浓度由具体实验要求确定。 

5.向培养板中加入足量的染液以覆盖全部细胞,室温避光孵育 15-30 min。为避免细胞凋亡进程,孵育过程可在冰上操作,但孵育时间至少延长至 30 min。 

6.用 1 X 结合缓冲液清洗细胞。 

7.将孵育有细胞的盖玻片置于载玻片上,载玻片可提前加一滴 1 X 结合缓冲液;对于培养在小室内的细胞,可直接加入足量的 1 X 结合 缓冲液覆盖细胞。 

8.使用合适的滤光片观察细胞。CL488-Annexin V 可用 FITC 适用的滤光片,PI可用 Cy3或者 Texas 适用的滤光片。

注意

1.荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。 

2.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

3.为确保结果准确,细胞在染色后须尽快完成检测。

光谱特性

CL488-Annexin V: Ex/Em=490/515 nm

PI: Ex/Em=535/617 nm (with DNA)

Publications

ApplicationTitle

Molecules

Naringenin Induces ROS-Mediated ER Stress, Autophagy, and Apoptosis in Human Osteosarcoma Cell Lines.

Authors - Chiang-Wen Lee