CoraLite® Plus 488-Annexin V 和 PI 细胞凋亡检测试剂盒

使用方法

下列实验方案以利用星形孢菌素诱导 Jurkat 细胞凋亡为例，如果使用其他诱导剂和其他类型的细胞，实验条件需要略作调整。

一、流式细胞检测 

1.根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。此外，设定一组样品做单染，用于调节补偿。

2.收集细胞。悬浮细胞：300 g，4 ℃ 离心 5 min 收集细胞； 贴壁细胞：用不含EDTA 的胰酶消化后300 g，4 ℃离心收集细胞，胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。

注：用胰蛋白酶消化后，将细胞在最佳细胞培养条件和培养基中恢复约 30 min，然后再染色。胰蛋白酶消化会暂时破坏质膜，允许 Annexin V 结合磷脂酰丝氨酸在细胞膜的细胞质表面上，从而导致假阳性染色。

3.用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300 g，4 ℃下离心5 min，收集1-5×10⁵个细胞并用 100 uL 1×结合缓冲液重悬细胞。  

4.每管加入 4-5 uL 的 CL488-Annexin V 和 5 uL 的 PI 工作液。

注：我们推荐准备两管额外的流式管，每管中只加入一种单染染料（CL488-Annexin V 和 PI），用于流式单染的补偿调节。

5.室温避光孵育 10-15 min，为避免细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作。 

6.每管加入 400 uL 的 PBS 或 1 X 结合缓冲液，尽快通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。CL488-Annexin V 由 488 nm 激光激发，检测荧光发射光谱在 530 nm 处（FITC 通道），PI 通道发射光谱约在 617 nm 处。

注：PBS 或 1× 结合缓冲液的选择根据不同凋亡处理以及不同细胞具体选择。

二、荧光显微镜检测

对于悬浮细胞，可参照流式细胞检测的方法进行具体操作。 

1.在盖玻片或载玻片小室中接种细胞。 

2.根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。 

3.用 PBS 洗涤细胞。 

注：细胞收集后如果不用 PBS 清洗，可以用含血清的培养基直接替代 Annexin V 结合缓冲液，但是 Annexin V 的使用浓度需要重新优化。 

4.每 100 uL 的 1× Annexin V 结合缓冲液中加入 5-25 uL 的 CL488-Annexin V 和 5 uL 的 PI。

注：最佳使用浓度由具体实验要求确定。 

5.向培养板中加入足量的染液以覆盖全部细胞，室温避光孵育 15-30 min。为避免细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作，但孵育时间至少延长至 30 min。 

6.用 1× 结合缓冲液清洗细胞。 

7.将孵育有细胞的盖玻片置于载玻片上，载玻片可提前加一滴 1× 结合缓冲液；对于培养在小室内的细胞，可直接加入足量的 1× 结合 缓冲液覆盖细胞。 

8.使用合适的滤光片观察细胞。CL488-Annexin V 可用 FITC 适用的滤光片，PI可用 Cy3或者 Texas 适用的滤光片。