CoraLite®488 TUNEL 凋亡检测试剂盒(绿色荧光)

Cat No : PF00006



产品介绍

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解,这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片 段约为 180 bp-200 bp 的整数倍,表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱 。本试剂盒采用 TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 在凋亡细胞断裂 DNA 的 3'-OH 末 端 催 化 掺 入 CL488-dUTP。CL488-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL法可以选择性的检测凋亡细胞,而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。

  组分20T50T
 TUNEL Equilibration Buffer
2 X 1 mL5 mL
 CL488 TUNEL Reaction Buffer1 mL2 X 1.25 mL
 TdT Enzyme20 μL50 μL
 Proteinase K (2 mg/mL)40 μL100 μL
 DNase I (2 U/μL)5 μL13 μL
 10 X DNase I Buffer100 μL260 μL


保存条件

-20℃储存;TUNEL Reaction Buffer 避光储存于 -20℃,避免反复冻融。本产品在推荐条件下可以储存2年。 

注:TUNEL Equilibration Buffer 和 TUNEL Reaction Buffer 中含有有毒、致癌成分 Sodium cacodylate trihydrate 和 Cobaltous chloride,使用时请佩戴口罩、手套,接触皮肤后,请立即用大量水冲洗,废液请按有毒物质处理。

使用方法

实验材料(自备) 

1、PBS缓冲液 (pH~7.4);     2、4% 多聚甲醛 (in  PBS);     3、牛血清白蛋白(BSA) 或正常的羊、牛血清;     4、70%乙醇 (自选);     5、脱蜡溶剂 (石蜡切片样本); 

实验步骤

一、样本准备: 

1.细胞样品 

1)可选:准备一份阴性对照样本(加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液)。 

2)PBS 清洗细胞两次。 

3)细胞固定:加入适量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液,4℃放置 30 min。 

4)PBS 清洗细胞两次。 

5)通透细胞:加入冰上预冷的 70% 乙醇,在 -20℃孵育 4 h。细胞能在 70% 乙醇中 -20℃的条件下保存一周。或者细胞可用含 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液通透,室温放置 20 min。 

6)PBS 清洗细胞两次。 

2.石蜡组织切片 

1)室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次,每次 5 min,以彻底脱掉石蜡。 

注:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。 

2)室温下,将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次,每次 5 min。 

3)室温下,将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇(95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗 1 次,每次 5 min。 

4)室温下,将切片依次浸没于纯水、1 X PBS中各漂洗 1 次,每次 3 min,用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。 

5)用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓,以便下游通透与标记。 

6)按 1:100 的比例,将 2 mg/ml 的 Proteinase K 溶液用 1 X PBS 稀释,使其终浓度为 20 μg/mL。每个样本上滴加 100 μL稀释好的 Proteinase K 溶液,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育 20min。(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同 类型组织样本进行优化)。 

注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要优化孵育时间长短。时间一般为 10-30 min,4 μm 左右的片子可以用 10 min,30 μm 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。 

7)PBS 浸润清洗切片 2 次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。 

注:这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。

3.冰冻组织切片 

1)将冰冻切片放置于室温的片架上,室温 20 min,晾干。 

2)将载玻片浸没在 4% 多聚甲醛溶液(in PBS)中,室温固定 30 min。 

3)PBS 浸润清洗切片 2 次,每次 5 min。 

4)用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。 

5)按 1:100 的比例,将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 X PBS 稀释,使其终浓度为 20 μg/mL。每个样本上滴加 100μL 稀释好的 Proteinase K 溶液,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育 10 min。Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类 型组织样本进行优化)。 

注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要优化孵育时间长短。时间一般为 10-30 min, 4 μm 左右的片子可以用 10 min,30 μm左右的可用 30 min,需摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。 

6)PBS 浸润清洗切片 2 次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。 

4.阳性处理(仅阳性对照进行此步骤,其他样品直接进行 TUNEL 反应步骤) 

1)按 1:10 的比例用 ddH2O 将 10 X DNase I Buffer 稀释成 1 X DNase I Buffer 备用。 

2)滴加 100 μL 1 X DNase I Buffer 到已通透的样本上,室温平衡 5 min。 

3)用 1 X DNase I Buffer 以 1:100 稀释 DNase I (2 U/μL), 使其为终浓度 20 U/mL 的工作液。 

4)轻轻吸掉多余液体,加入 100 μL 浓度为 20 U/mL DNase I 工作液,室温孵育 10 min。 

5)轻轻吸掉多余液体,PBS 清洗样品 2 次。 

二、TUNEL 反应 

1.每个样本加入 100μL 平衡缓冲液,孵育 5 min。 

2.预先配制 TUNEL 反应混合液:每个样本需要已加入 1μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反应缓冲液。 

3.弃去平衡缓冲液,用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体,每个样本加入 50 μL TUNEL 反应混合液。 

1)贴壁细胞,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃ 避光孵育 60 min。 

2)悬浮细胞,可加入微孔板中,采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管,使之充分反应。37℃避光孵育 60 min。 

3)组织样本,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内,湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育2 h。 

4.去掉反应液,在 1 X PBS 的染色缸中浸泡润洗 2 次,每次 5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100,其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3 次,每次 5 min,以降低背景。 

5.(可选)复染:每个样本滴加浓度为 2 μg/mL 的 DAPI 染液,避光室温孵育 10 min。染色完后,轻轻去掉染液,并将样本在 1 X PBS 中浸泡润洗 3 次,每次 5 min。 

6.(可选)封片:将切片样本先纯水浸没 5 min,再依次放入 70% 乙醇、80% 乙醇、90% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇各浸没 5 min,最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理 2 次,每次 5 min。(通风厨中操作)。脱水完成后,擦去切片周围的液体,每个切片样本滴加 50μL 抗荧光淬灭封片液,盖上盖玻片,用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片,去除气泡以使封片完全。 

7.用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析,CL488是一种绿色荧光染料,激发波长、发射波长分别为 490 nm, 515 nm(凋亡细胞应被标记上明亮的绿色荧光,没有加入 TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光)。

注意

1.荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。 

2.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

其他

CoraLite®488 标记,简称 CL488,该染料和 FITC 等染料类似。

Ex/Em: 490/515 nm


Publications

ApplicationTitle

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