核蛋白与胞浆蛋白抽提试剂盒

使用方法

1、提取前准备：将试剂盒中试剂室温解冻，解冻后放置于冰上。提前4℃预冷离心机。核蛋白抽提试剂A、核蛋白抽提试剂B、核蛋白洗涤液A、核蛋白洗涤液B根据提取的样本量分别取出对应体积的试剂，在使用前按100:1添加蛋白酶抑制剂混合液（100×）备用。

2、样品预处理

a、对于细胞：收集细胞4℃，500 g离心5 min，用预冷的PBS洗涤两遍，尽可能吸取残留的PBS。然后在冰上，按每2000-5000万细胞直接加入1 mL的预冷核蛋白抽提试剂A。

b、对于组织：取新鲜的动物组织，用预冷的PBS洗净组织块上附着的脂肪和血液等杂质，用滤纸吸干水分后称重，在离心管中将组织块剪碎，然后在冰上，按每100 mg组织加1 mL预冷的核蛋白抽提试剂A。

3、将样品转移到合适大小的预冷玻璃匀浆器中，在冰浴条件下对样品匀浆。

注：不同的样品所需匀浆次数不同，培养细胞建议匀浆1-2次，组织样本建议5-10次。鉴定方法：取20 uL匀浆2次后的细胞样品或匀浆5次后的组织样品，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液，混匀，在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性（蓝色）细胞数目的比例，当阳性（蓝色）细胞破碎达到50%即可停止匀浆，请勿过度匀浆。若阳性（蓝色）细胞比例未达到50%，适当增加1-2次匀浆，随后按照同样的方法使用台盼蓝溶液进行鉴定。

注：对于培养的细胞也可以采用涡旋震荡法和反复冻融法来破碎细胞。

涡旋震荡法：将步骤2中已经加入了核蛋白抽提试剂A的样品，在涡旋仪上剧烈涡旋1 min（涡旋10 s，停10 s），然后冰上放置2 min，重复涡旋及冰上放置步骤3次，然后取少量样品台盼蓝染色检测其细胞破碎程度，如果细胞破碎程度不足50%，可以增加剧烈涡旋次数，直到细胞破碎程度大于50%。

反复冻融法：将步骤2中已经加入了核蛋白抽提试剂A的样品，在液氮和室温依次反复冻融两次，然后取少量样品台盼蓝染色检测其细胞破碎程度，如果细胞破碎程度不足50%，可以增加反复冻融次数，直到细胞破碎程度大于50%。

4、样品匀浆液在冰上孵育10 min，期间每隔2 min上下颠倒一次，4℃，6500 g离心5 min，收集上清为胞浆蛋白。

注：吸取上清时不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留部分上清。

5、收集沉淀，用1 mL的核蛋白洗涤液A重悬沉淀。4℃，6500 g离心5 min，收集沉淀。

6、沉淀中加入1 mL的核蛋白洗涤液B重悬沉淀，在涡旋仪上剧烈涡旋1 min（涡旋10 s，停10 s）。4℃，6500 g离心5 min，再次收集沉淀。

7、沉淀中加入100 uL的核蛋白抽提试剂B重悬沉淀。在涡旋仪上剧烈涡旋2 min（涡旋10 s，停10 s），然后冰上放置10 min，重复涡旋及放置步骤3次。

8、4℃，16000 g离心10 min，收集上清为核蛋白。

9、根据收集到的核蛋白样品的体积，加入4倍体积的核蛋白稀释液。此时如果收集到的核蛋白粘度高，可对样品进行超声波处理，直至样品不粘稠。

注：如果出现样品粘度太高导致步骤8离心后无法分离沉淀和上清，可先加入4倍体积的核蛋白稀释液，并对样品进行超声波处理后再4℃，16000 g离心10 min，收集上清（核蛋白）。

10、根据实验需要，按照3:1比例，混合蛋白样品和SDS-PAGE上样缓冲液。100℃沸水浴加热5 min，以充分变性蛋白。冷却至室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。