通用型总蛋白提取试剂盒

使用方法

1、细胞样品

a、瓶内裂解法（效果最佳）：适用于所有的贴壁细胞

  （1）吸净培养基，用冰的PBS清洗细胞表面2遍（动作轻柔，防止细胞脱落），尽可能吸取残留的PBS。

（2）在冰上按每1000万细胞加入1 mL预冷的裂解液（使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物）于细胞瓶、培养板或培养皿中，用移液管吹散贴壁的细胞，对于贴壁紧的细胞也可使用细胞刮收集，收集裂解液，在冰上放置30 min，期间每10 min上下颠倒混匀一次。

b、离心法：适用于悬浮细胞和药物处理过的细胞

（1）使用细胞刮收集细胞悬液（连同培养基一起收集），4℃，500 g离心5 min，收集沉淀，沉淀用预冷的PBS洗涤两遍，收集细胞沉淀，尽可能吸取残留的PBS。

（2）按每1000万细胞加入1 mL预冷的裂解液，在冰上放置30 min，期间每10 min上下颠倒混匀一次。

注：（1）细胞的收集优先使用瓶内裂解法处理，瓶内裂解法可以有效的防止细胞在离心过程中破碎，能有效地提高总蛋白得率，同时也能保留细胞外基质（ECM）。

（2）对于药物处理过的贴壁细胞则推荐使用离心法收集，因为药物处理过的细胞往往贴壁不牢，在PBS清洗阶段容易丢失。

（3）不推荐使用胰酶消化，胰酶消化细胞不仅会造成细胞外基质（ECM）的完全丢失，同时会剪切一些对胰酶敏感的蛋白。

（4）一些细胞粘度高（HEK-293）和密度高的悬浮细胞（Jurkat、K562等）在加入细胞裂解液后容易形成絮状物，此时应及时的使用超声破碎仪将其打散。

2、组织样本

a、采集与保存：

（1）采集组织样本前先对动物去除血液（血液去除越干净越好），接着迅速解剖，采集所需要的组织样本。

（2）组织样本如需保存，可将采集的组织样本液氮速冻，然后转移至-80℃保存。

（3）取样顺序：最先取胃肠道消化系统相关组织，接着取肺（巨噬细胞含量高）、肝脏（蛋白种类多）、膀胱、生殖系统相关的组织（睾丸、卵巢、子宫、输卵管等），最后取心脏、脾脏、肾脏、骨骼肌、大小脑等组织。胃肠道消化系统相关组织推荐现取现制备，选用易降解蛋白提取试剂盒（PK10024)提取。

b、清洗

（1）对于血液含量丰富的组织样本如：心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等组织，剪碎使用冰的PBS洗涤液清洗2-3遍（可以适当按压排出血液），直至样本血红色变浅，滤纸吸干水分称重。

（2）对于脂肪含量丰富的组织样本，预先把样本放在几层纸巾上按压，去除部分脂类，然后再使用冰的PBS清洗1-2遍，滤纸吸干水分称重。

c、破碎及裂解

（1）液氮研磨法：将剪碎的组织块在研钵中加入液氮，快速研磨至细粉状，转移至EP管中，按每100 mg组织加1 mL预冷的裂解液（使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物），使用移液器上下吹打混匀，直至完全溶解。在冰上放置30 min，期间每10 min上下颠倒混匀一次。

  （2）匀浆法：按每100 mg组织加1 mL预冷的裂解液（使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物），将样品转移到合适大小的预冷玻璃匀浆器中，在冰浴条件下对样品匀浆30-50次。在冰上放置30 min，期间每10 min上下颠倒混匀一次。

注：不同的样品所需匀浆次数不同。鉴定方法：取20 ul匀浆30次后的组织样品，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液，混匀，在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性（蓝色）细胞数目的比例，当阳性（蓝色）细胞完全破碎，即可停止匀浆。若阳性（蓝色）细胞破碎不完全，则可适当增加5-10次匀浆，随后按照同样的方法使用台盼蓝溶液进行鉴定。

 （3）冷冻研磨机法：提前开启冷冻研磨机预冷，将吸干水分的组织样本剪成1-2 mm左右的小块，按照每管100 mg分装到2 mL离心管，同时每管加入1粒5 mm的研磨珠。将离心管和适配器放入液氮里浸泡速冻。将离心管和适配器转移到冷冻研磨机，使用65 Hz研磨45s，如果研磨效果不理想可中断15s后重复研磨一次。每管加1 mL预冷的裂解液（使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物），使用移液器上下吹打混匀，直至完全溶解。在冰上放置30 min，期间每10 min上下颠倒混匀一次。

注：（1）优先推荐选用液氮研磨法和冷冻研磨机法，其破碎效果最佳；如选用匀浆法，需在冰水浴中对样品进行匀浆。

（2）使用冷冻研磨机法对液氮速冻过的样本进行破碎，对离心管的材质要求比较高，需选用专用的离心管。

3、昆虫样本

     将昆虫清洗干净，使用液氮研磨法、匀浆法或冷冻研磨机法（参考组织样本的破碎及裂解方法）将其破碎，按每50-100 mg样本加1 mL预冷的裂解液（使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物），在冰上放置30 min，期间每10 min上下颠倒混匀一次。

4、植物样本

   将植物清洗干净，使用液氮研磨法或冷冻研磨机法（参考组织样本的破碎及裂解方法）将其破碎（越碎越好），按每100-200 mg样本加1 mL预冷的裂解液（使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物），在冰上放置30 min，期间每10 min上下颠倒混匀一次。

   注：植物样本不推荐使用匀浆法，液氮研磨法或冷冻研磨机法中液氮对破碎植物的细胞壁有非常好的效果。

5、超声处理

   将裂解的蛋白样品放在冰上超声破碎，200W，2 min（开2s，关2s），充分打断核酸序列（用于Co-IP实验的样品不要对样品进行超声波处理）。

6、样品的使用与保存。

6.1  用于免疫沉淀、ELISA等非变性蛋白分析实验，4℃，10000 g离心5 min分离上清，取部分样品用来测浓度，剩下的蛋白样品可直接分成数管保存在-20℃或-80℃。

6.2  用于免疫印迹的变性蛋白分析实验，取部分样品用来测浓度，剩下的蛋白样品按照3:1比例，混合蛋白样品和SDS-PAGE上样缓冲液。100℃沸水浴加热5 min，以充分变性蛋白。冷却至室温后，4℃，10000 g离心5 min分离上清，可直接上样到SDS-PAGE胶加样孔或分成数管保存在-20℃或-80℃。

注：用于免疫印迹的变性蛋白分析，在加入SDS-PAGE上样缓冲液煮样后再离心，可提高总蛋白的得率。