作者:Proteintech 高级科学家Jamuna Karanankattil Sukumaran

人中脑类器官为研究多巴胺能神经元发育、帕金森病发病机制以及人类特异性神经生物学开辟了全新视角。Jo等人于2016年发表在《Cell Stem Cell》上的里程碑式研究，首次建立了可稳定制备含功能性多巴胺能神经元及神经黑素的中脑样类器官（hMLOs）的标准化方案。

但所有从事类器官研究的人都深知：已发表的实验方案仅仅是成功的一半。

真正的成功来自细微调整、精准的时间把控、培养状态的经验判断，以及那些只有实操才能掌握的细节。本文将从基本原理、实操步骤与经验心得等方面，分享如何稳定制备结构良好、状态健康的中脑类器官。

一、选用高质量多能干细胞

多能干细胞的质量是类器官发育的核心基础。低代次人胚胎干细胞（hESCs，传达次数＜40代）是保障实验结果一致性的必要条件。

关键注意事项：

1. 细胞集落形态均一
2. 自发分化水平极低
3. 培养体系无支原体污染
4. 多能性标志物稳定表达（OCT4、NANOG、SOX2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等）

若起始培养物存在异质性，FOXA2诱导效率、神经上皮结构与整体模式化效率都会显著下降。

二、制备均一的拟胚体

拟胚体（EB）阶段的均一性直接影响下游模式。将相同数量细胞接种至超低吸附U型或V型培养板，可获得均一的EB。

关键注意事项：

1. 每孔接种2500–3000个细胞，可获得最佳EB（约400µm）
2. 前24小时加入ROCK抑制剂（10 µM）
3. EB应结构致密、呈球形
4. 避免过度生长：体积过大的EB易发生中心坏死

EB大小均一，可保证早期分化诱导阶段生长因子均匀扩散。

三、精准调控早期模式化：双重SMAD抑制联合CHIR干预

培养第0-4天，联合使用SMAD抑制剂（Noggin、SB431542）和Wnt激活剂（CHIR99021），可促进神经外胚层形成，并通过Wnt信号诱导中脑分化。

关键注意事项：

1. CHIR浓度决定脑组织前后轴（吻侧-尾侧）命运
2. 低浓度的CHIR可以诱导人多能诱导干细胞向吻侧或前侧发育，随着CHIR浓度升高，会逐步诱导更偏向尾侧或后侧发育，包括后脑与脊髓。
3. 多数实验室使用7–1.0 µM CHIR效果最佳，但不同细胞系对Wnt敏感性不同，必须逐株优化。若FOXA2或OTX2表达水平偏低，优先调整CHIR浓度。

四、中脑命运定向分化依赖SHH与FGF8信号激活

培养第4-7天加入SHH和FGF8，是诱导EB向中脑分化的核心步骤。此阶段理想分化效果需出现以下特征：

1. FOXA2+底板祖细胞
2. OTX2+中脑祖细胞
3. 中脑早期标志物LMX1A、CORIN表达

关键注意事项：

1. SHH对反复冻融极敏感，建议分装小体积使用
2. SHH活性轻微下降，即可降低FOXA2诱导效率
3. 延长作用时间（3-4天）可提升底板均一性

此阶段直接决定后续TH+细胞的生成。

五、把握包埋时机，构建3D结构

培养第7天是转向3D形态发生阶段，神经外胚层芽开始形成。

将EB包埋于基质胶（Geltrex）或水凝胶中（VitroGel），主要作用有：

1. 促进神经上皮扩增
2. 维持细胞顶–基底极性
3. 有利于脑室区–中间区–边缘区（VZ–IZ–MZ）结构形成

关键注意事项：

1. 若使用Geltrex，需在冰上操作，防止提前凝固
2. 包埋过早或过晚都会破坏组织分层

六、摇床悬浮培养，优化供氧与生长微环境

包埋后，将类器官转入超低吸附板，置于摇床（65–85 rpm）培养。

摇床培养可显著改善：

1. 营养物质分布
2. 气体交换能力
3. 促进神经上皮褶皱形成
4. 避免类器官相互融合粘连

多巴胺能神经元代谢活性高、对低氧环境极为敏感，摇床培养对其存活至关重要。

七、添加神经营养因子，促进多巴胺能神经元成熟

从培养第8天开始，向培养基加入BDNF、GDNF、抗坏血酸、cAMP（db-cAMP）。

主要作用：

1. 促进TH+多巴胺能神经元存活
2. 增强神经突触生长
3. 支持多巴胺合成
4. 促进突触成熟

注意：抗坏血酸必须现配现用。氧化的抗坏血酸会抑制多巴胺能神经元成熟与TH表达。

常见问题及解决办法

培养结果展示

图1：中脑类器官分化第15天、第33天免疫荧光染色结果；A、B为第15天、33天FOXA2染色；C、D为第15天、33天NESTIN与SOX2共染。20倍放大，10μm切片。

图2：中脑类器官分化第15天、第33天MAP2与Ki67免疫荧光共染结果。20倍放大，10μm切片。

图3：中脑类器官分化第33天免疫荧光染色；A为OTX2染色、B为Nurr1染色、C为MASH1与MAP2共染。

图4：中脑类器官分化第33天标志物染色；A（4倍镜）、B（10倍镜）为TH染色；C（10倍镜）、D（20倍镜）为DAT染色。切片厚度25μm

本分化实验所用的生长因子均来自Proteintech旗下Humankine®HEK293细胞表达的人源重组蛋白，可确保天然人源翻译后修饰，直接影响蛋白稳定性、受体结合能力与下游信号强度。通过使用HEK293细胞表达的人源生长因子，给予类器官更贴近真实人体生理环境的信号，从而实现更稳定的FOXA2诱导、更优的神经上皮结构组织，以及更可靠的多巴胺能神经元成熟效果。 

Proteintech可提供：

• 中脑类器官制备所需细胞因子

• 中脑类器官鉴定所需抗体